Гибель клеток может быть вызвана активизацией различных молекулярных путей, в том числе апоптоза, некроза и аутофагии, которые характеризуются определенными временными, морфологическими, биохимическими и генетическими особенностями. В организме возможны различные варианты гибели, тогда как in vitro все типы гибели клеток приводят к вторичному некрозу. Вторичный и первичный некрозы имеют общие черты, в частности для них характерно нарушение целостности клеточных мембран и последующий выброс клеточного содержимого в окружающее внеклеточное пространство. Тогда как в организме при апоптозе выброса не регистрируется.
Оценка жизнеспособности клеток in vitro базируется на анализе целостности мембран или определении в межклеточном веществе специфических внутриклеточных соединений — лактатдегидрогеназы. Однако такие тесты оценки жизнеспособности клеток обычно возможны на поздней стадии процесса гибели и обычно сопряжены с несколькими этапами подготовки морфологического препарата.
Определенные морфологические изменения, в частности, изменение объема тоже отражают процессы гибели клеток. Например, во время апоптоза отмечается уменьшение объема клетки, а некроз характеризуется её отеком, незначительные изменения объема происходят и в норме. Для возвращения к нормальному размеру и поддержания ионного гомеостаза клетка регулирует объем посредством открытия различных ионных каналов. Таким образом, если механизмы регуляции объема инактивируются или наоборот, чрезмерно активируются, это приводит к неконтролируемым изменениям объема, нарушению ионного гомеостаза и запуску процесса гибели.
В статье представлена методология быстрой оценки жизнеспособности клеток in vitro с помощью цифровой голографической микроскопии (DHM) с высокочувствительным количественным и динамическим измерением клеточной формы и объема. DHM имеет ряд преимуществ, таких как автоматическое обнаружение, измерение и оптимизация изображений. DHM используется для выявления процессов раннего изменения объема клетки в ответ на определенные, ведущие к некрозу, события. Оценена корреляция активности этих процессов с развитием последующего некроза клетки, оцениваемого стандартным методом.
Исследована запускающая процессы апоптоза или некроза глютомат-индуцированная экзотоксичность — форма смерти нейронов, характерная для нейродегенеративных и ишемических процессов центральной нервной системы. Глютомат-индуцированная экзотоксичность характеризуется отеком нейронов, вследствие значительного увеличения внутриклеточной концентрации Ca2+ и Na+ и трансмембранного движения воды.
Материалы и методы. Исследование было выполнено на первичных культурах нейронов коры головного мозга мышей. Жизнеспособность клетки проверена стандартным методом с трипановым синим. Краситель позволяет оценить целостность клеточной мембраны, меняющей проницаемость после активации механизмов некроза клетки. Ядра нежизнеспособных клеток окрашиваются в синий цвет связывающимся с ДНК пигментом.
Клетки на 3 минуты погружались в изотонический раствор с десятикратным разведением красителя. Низкая концентрация и короткая выдержка не позволяла окрашиваться здоровым клеткам.
Экзотоксические эффекты изучались на примере 1-2 минутного воздействия различных концентраций глютамата — от 25 до 100 ммоль/л. Для активации глутаматом рецепторов NMDA в раствор добавляли 10 ммоль глицина.
Измерения выполнялись в реальном времени на стандартной установке цифровой голографической микроскопии — DHM.
Результаты и выводы. Выявлены два вида глютомат-индуцированных клеточных ответов: фатальное необратимое изменение формы и обратимый ответ с восстановлением формы. Последний характеризуется быстрым восстановлением морфологии нейронов, что обусловлено эффективным поддержанием ионного гомеостаза. Напротив, необратимое изменение формы можно интерпретировать как постоянную дисрегуляцию внутриклеточного ионного гомеостаза.
Фатальное необратимое изменение формы может служить ранним индикатором последующего некроза клетки, вследствие постоянного нарушения ионного гомеостаза. Визуальные различия между двумя типами клеточного ответа очевидны: резко отличаются выраженность изменения формы – от нескольких градусов для обратимого ответа и десятков градусов для необратимого, отмечается существенная несхожесть морфологии.
Для обнаружения некроза клеток была продемонстрирована значительная корреляция оценки жизнеспособности клеток при использовании цифровой голографической микроскопии (DHM) и стандартного метода с красителя. Цифровая голографическая микроскопия позволяет оценить изменения в жизнеспособности клетки на 2-3 часа раньше стандартного метода.