Эффективный способ придания микроносителям способности обеспечивать адгезию клеток — нанесение на поверхность гранул из незаряженного декстрана коллагена (Cytodex 3) или создание микроносителей целиком из денатурированного коллагена (Ventragel Цитолар 1 Gelatin).
В отличие от полученных положительно заряженных микроносителей на основе поперечно сшитого декстрана, коллагеновые микроносители незначительно адсорбируют компоненты питательной среды и секретируемые клетками вещества. Это дало основание считать, что коллаген и его производные являются наиболее перспективной основой для разрабатываемых микроносителей.
Для поддержания микроносителей во взвешенном состоянии пользуются различными способами. Чаще всего для культивирования на микроносителях применяются сосуды с подвешенным перемешивающим устройством (спиннеры) объемом от 2-20 мл до нескольких сотен литров. Усовершенствование конструкции спиннерных сосудов направлено на создание более мягких условий перемешивания. Происходит более эффективное прикрепление клеток к микроносителям.
Между необходимой посевной концентрацией клеток и способностью этих клеток к образованию колоний существует обратная связь. Например, для образования монослойной культуры с эффективностью клонообразования более 30% было достаточно пяти или даже меньше прикрепившихся к микроносителю клеток. Для культур с эффективностью клонообразования менее 10% число прикрепившихся к микроносителю клеток должно быть выше 103. Обычно для клеток перевиваемых линий посевная концентрация составляет 5-10х103 кл/мл при концентрации микроносителей 1-3 г/л, а для первичных клеток 15-40х103 кл/мл и до 1х103 кл/мл.
Метод культивирования клеток на микроносителях позволяет проводить визуальный контроль культур клеток. Они могут быть подготовлены для световой микроскопии и для электронно-микроскопического исследования. Для подсчёта клеток, выросших на микроносителях, культуры последних либо трипсинизируют, либо подсчитывают ядра клеток, применяя модифицированную методику Санфорд. Разработана также методика сбора клеток с микроносителей в больших объёмах. Обработка культур клеток в вибромиксере раствором трипсина позволяет собрать около 90% клеток.
Кроме обычной методики культивирования клеток на микроносителях с применением трипсина, культуры на микроносителях могут быть культивированы без применения каких-либо диспергирующих агентов. Установлено, что клетки, образовавшие монослой на поверхности культурального сосуда, мигрируют на микроносители, образуя на них монослойные культуры. Клетки могут мигрировать также с одних частиц микроносителей на другие. Уменьшение содержания в питательной среде ионов Ca2+ способствует миграции клеток от одних частиц микроносителей к другим.
Клетки, выросшие на микроносителях, можно хранить в жидком азоте двумя способами:
- предварительно собрав клетки с микроносителей;
- замораживая монослойные культуры на микроносителях.
Статью подготовил и отредактировал: врач-хирург Пигович И.Б.