Одной из основных причин отсутствия ощутимых результатов в борьбе с туберкулёзом в России является постоянное увеличение числа больных, у которых выявляют лекарственно-устойчивые штаммы M. tuberculosis, особенно к препаратам первого ряда — рифампицину (Р) и изониазиду (И), что классифицируется как МЛУ.
По данным В.И. Литвинова и соавт. (2005), в Москве среди впервые выявленных больных туберкулёзом лёгких 8–10% составляют лица, заражённые МЛУ M. tuberculosis, и до 25% — пациенты с хроническим течением процесса. В Российской Федерации процент таких больных значительно выше и составляет от 16 до 50% соответственно.
Применяемые микробиологические методы для определения чувствительности к противотуберкулёзным препаратам занимают 1,5–3 мес, что не позволяет своевременно начать проведение индивидуальной специфической терапии, а результаты часто могут быть использованы только для ретроспективного анализа. Более дорогие и менее распространённые альтернативные методы определения чувствительности на жидких средах позволяют сократить сроки определения до 3 нед.
С применением молекулярно-биологических методов определение лекарственной чувствительности M. tuberculosis возможно в короткие сроки (до 2 сут), что, в свою очередь, позволит незамедлительно назначить адекватную антибактериальную терапию. Поскольку молекулярные механизмы резистентности M. tuberculosis, ассоциированные с мутациями в бактериальной ДНК к основным противотуберкулёзным препаратам Р и И, довольно хорошо изучены, решение данной диагностической задачи в первую очередь связано с разработкой быстрого и надёжного метода идентификации мутаций, ответственных за возникновение лекарственной устойчивости.
Среди молекулярно-биологических методов, позволяющих выявить мутации в ДНК M. tuberculosis, наиболее близким к внедрению в лабораторную практику является метод биологических микрочипов, разработанный в Институте молекулярной биологии (ИМБ) им. В.А. Энгельгардта, — «ТБ-БИОЧИП». С его помощью можно определять наличие в образце микобактерий туберкулёзного комплекса и проводить одновременное определение резистентности M. tuberculosis к двум препаратам Р и И. Метод включает двухэтапную мультиплексную ПЦР участков генов (мутации в которых приводят к возникновению устойчивости), гибридизацию и регистрацию продуктов реакции на биочипе. Дискриминирующие олигонуклеотиды, размещённые на биочипе, способны обнаруживать мутации в генах rpoB (для 95% рифампицинрезистентных штаммов) и katG, inhA, ahpС (для 80% изониазидрезистентных штаммов). Результаты гибридизации регистрируются на портативном анализаторе «Чип-детекторе» с соответствующим программным обеспечением («Биочип-ИМБ», Россия).
Интерпретацию результатов проводят путём сравнения интенсивностей флюоресцентных сигналов. Если интенсивность сигнала контрольной ячейки (в которой содержится олигонуклеотид, комплементарный исследуемому участку ДНК M. tuberculosis дикого типа) больше, чем в соответствующих ячейках, содержащих олигонуклеотиды, комплементарные ДНК, имеющих мутацию(и), анализируемый образец относят к дикому типу, т.е. принадлежащему к чувствительному штамму. Если в какой-либо из ячеек регистрируется больший флюоресцентный сигнал, чем в соответствующей контрольной ячейке, то анализируемый образец имеет точечную мутацию и, соответственно, выдаётся заключение, что в анализируемом образце обнаружены микобактерии туберкулёза, устойчивые к Р и/или И.
Всего с помощью микрочипа в настоящее время можно определять 29 типов мутаций в гене rpoB ДНК M. tuberculosis и 19 наиболее распространённых типов мутаций в трёх генах katG, inhA, ahpC, ответственных за резистентность к И.
Совпадение результатов определения резистентности к Р и И с помощью метода абсолютных концентраций и биологических микрочипов для выделенных культур M. tuberculosis составило 98,5%, для разнообразного диагностического материала — 88,8%.
Изучение штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом жителей различных городов, к настоящему времени позволило выявить более 50 различных сочетаний мутаций, ответственных за резистентность к Р и И.
Для M. tuberculosis, устойчивых к Р, характерны мутации rpoB гена в 531-м, 526-м, 533-м, 516-м кодонах. Для гена katG — в 315-м и, значительно реже, в 328-м кодоне. В гене inhA были обнаружены замены нуклеотидов в -15-м и -8-м положении относительно сайта инициации трансляции. В гене ahpC мутации идентифицированы в -6-м, -10-м, -12-м положении относительно сайта инициации транскрипции. С помощью биологических микрочипов определяют наличие мутаций в кодонах и замены на ряд аминокислот в некоторых кодонах, которые, как правило, не изучаются исследователями. В сумме выявляемость мутаций увеличивается на 18,0% для гена rpoB и на 13,0% в генах, ассоциированных с резистентностью к изониазиду. Увеличивается процент МЛУ M. tuberculosis за счёт определения мутаций в генах oxyR и inhA. Были выявлены штаммы M. tuberculosis, имеющие резистентность за счёт наличия мутаций только в этих генах. В M. tuberculosis, полученных от больных с впервые выявленным туберкулёзом лёгких, определили МЛУ в 10,4% случаев.
Надо отметить, что среди исследуемых штаммов M. tuberculosis в 1,5% случаев имелись мутации во всех четырёх изучаемых генах. В трёх генах мутации имели 20,0% штаммов, в двух — 78,1%. Штаммов с мутациями в одном гене было 12,5%. Кроме того, были получены различия в процентном соотношении типов мутаций по разным генам в штаммах M. tuberculosis у жителей Москвы, Кишинёва, Астрахани, Нижнего Новгорода, Алматы, Саратова.
Возникновение и широкое распространение M. tuberculosis с МЛУ может быть следствием ряда причин, в первую очередь несоблюдения или неадекватности химиотерапии, но часто длительной (до 2–3 мес) и/или недостоверной бактериологической диагностики туберкулёза. В результате новые случаи заболевания всё чаще развиваются при первичном заражении M. tuberculosis с МЛУ и, таким образом, создаются условия для формирования нового резервуара инфекции, первоначально устойчивой к основным противотуберкулёзным препаратам. Лечение таких больных препаратами первого ряда не только не перспективно, но даже вредно.
Весьма успешный результат лечения может быть достигнут только в случае максимально быстрого получения результатов лекарственной чувствительности M. tuberculosis и своевременного применения эффективных противотуберкулёзных препаратов. Использование в лечении левовращающих «респираторных» фторхинолонов, таких, как моксифлоксацин или левофлоксацин, обладающих высокой активностью в отношении M. tuberculosis с МЛУ, требует быстрой и специфической диагностики чувствительности микобактерий к этой группе препаратов. Такими возможностями, с нашей точки зрения, обладают недавно созданные молекулярно-биологические методы, в частности технология гибридизации амплифицированной ДНК участков генов, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, на биологическом микрочипе.
С учётом важности быстрого определения чувствительности M. tuberculosis к фторхинолонам у больных с МЛУ туберкулёзом в ИМБ недавно была разработана новая тест-система «ТБ-БИОЧИП-2», позволяющая определять 9 типов мутаций в РОУФ области гена gyrA M. tuberculosis (регион, определяющий устойчивость к фторхинолонам), содержащей пять полиморфных кодонов: позиции 88, 90, 91, 94 и 95. Кодон 95 содержит естественно-обусловленный полиморфизм либо Ser (АGС), либо Thr (АСС), не приводящий к устойчивости M. tuberculosis к фторхинолонам. Метод был отработан на базе Московского городского научно-практического центра борьбы с туберкулёзом на биологических секретах лёгких и культурах M. tuberculosis, выделенных от больных туберкулёзом, и в 2006 г. был зарегистрирован.
