Циркулирующие раковые клетки

Наиболее загадочной является способность эпителиальной злокачественной клетки выживать в системном кровотоке, сопротивляясь негативному влиянию гемодинамического и иммунологического стресса. Отличительная особенность циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), которые приобрели в результате эволюции клона наиболее агрессивный метастатический потенциал, позволяет рассматривать их как основной механизм опухолевой прогрессии. Изучение биологических характеристик циркулирующих клеток в отличие от множества других злокачественных клеток, представленных в первичной опухоли, позволило говорить о принципиально новых онкомаркерах, обладающих высоким прогностическим значением.

Впервые инвазию злокачественными клетками вен и лимфатических сосудов у больного базальноклеточным раком кожи обнаружил K. Tirsch в 1865 г. В 1869 г. Ashworth сообщил о наличии злокачественных клеток в сосудах больного, умершего от метастатического рака. О циркулирующих клетках как о «метастазах в кровь» сообщал также Н.Н. Петров. Однако только в последнее время благодаря развитию методов молекулярной визуализации опухоли были раскрыты основные механизмы реализации программы метастатического каскада – биологического феномена, который начинается с процесса эпителиально-мезенхимального перехода, утраты клеточной адгезии, приобретения опухолевой клеткой свойств аномальной подвижности и инвазивности, циркуляции клеток в кровотоке и заканчивается колонизацией злокачественными клетками отдаленных органов с последующей реализацией гематогенных метастазов.

Эпителиально-мезенхимальный переход

Феномен эпителиально-мезенхимального перехода встречается в физиологических условиях (эмбриональный морфогенез), при различных видах воспаления, формировании фиброза, а также является неотъемлемой частью канцерогенеза (3 тип по классификации R. Weinberg). Клетки при эпителиально-мезенхимальном переходе приобретают свойства раковых стволовых клеток с реализацией своих основных функций – метастазирования, колонизации и пролиферации – в отдаленных органах.

Во время эпителиально-мезенхимального перехода происходят морфологические трансформации, проявляющиеся изменением размера и формы клеток, наблюдаются плеоморфизм клеток и ядер, гиперхромазия и гиперплоидность, а также отмечается увеличение их митотической активности. Феномен эпителиально-мезенхимального перехода оказывает влияние на формирование гетерогенности циркулирующих опухолевых клеток, а также обусловливает технические трудности их обнаружения и фенотипирования.

Интравазация опухолевых клеток

В экспериментальных моделях было установлено, что ежедневно в кровоток из 1 г опухолевой ткани поступает 1 млн клеток, при этом только 1 клетка из 40 может достигнуть преметастатической ниши и только 0,01% клеток реализуются в макрометастаз.

Эпителиальные клетки в кровотоке имеют очень низкую выживаемость: 85% из них погибают, превращаясь в апоптотические тельца и попадая в «капиллярную ловушку» менее чем в течение 5 мин после интравазации. Этому способствуют гемодинамический стресс и взаимодействие с клетками иммунной системы.

Выживание злокачественной клетки в кровотоке происходит в том случае, если во время эпителиально-мезенхимального перехода в ней активировались антиапоптотические программы, позволяющие избегать состояния anoikis (одна из форм апоптоза, когда физиологическая смерть клетки происходит в результате нарушения межклеточной адгезии и взаимодействия с матриксом). Большинство выживших клеток с повышенным метастатическим потенциалом экспрессируют факторы, ингибирующие апоптоз, и являются устойчивыми к anoikis.

Выжившие в кровотоке клетки меняют свойства и могут обнаруживаться как в виде единичных циркулирующих клеток, так и в виде циркулирующих опухолевых микроэмболов (феномен коллективной миграции). Для описания солитарных циркулирующих опухолевых клеток используют термин высокодиссеминированная ангиогенная болезнь (highly angiogenic and disseminated). Эти клетки не делятся (находятся в фазе покоя G0). Этот факт объясняет устойчивость клеток к апоптозу.

Таким образом, большинство циркулирующих опухолевых клеток представлены в кровотоке в виде апоптотических телец, очень малое количество – в виде солитарных опухолевых клеток, а также в виде циркулирующих опухолевых микроэмболов.

Судьба выживших в кровотоке опухолевых клеток также различна. Часть клеток попадает в преметастатическую нишу и колонизирует отдаленные органы с последующей реализацией гематогенного метастаза. Преметастатической нишей для этих клеток могут быть ткани висцеральных органов и костный мозг.

Некоторые клетки, обогащенные во время циркуляции цитокинами и факторами роста (продукт активированных эндотелиальных и стромальных клеток), возвращаются в первичную опухоль (метастазируют «в себя»). Биологический смысл этого явления – стимуляция роста первичной опухоли. Таким образом, ткани первичной опухоли являются третьей преметастатической нишей для циркулирующих опухолевых клеток.

Наконец, некоторые клетки сохраняют способность циркулировать в кровотоке в течение длительного времени. Так, солитарные злокачественные клетки обнаруживаются в крови больных раком молочной железы через 10 лет после завершения радикального лечения.

Клиническое значение циркулирующих опухолевых клеток

В настоящее время Управление по контролю за качеством продуктов питания и лекарственных средств (FDA) рекомендует изучение циркулирующих опухолевых клеток при солидных опухолях различных локализаций (раке молочной железы, раке предстательной железы, колоректальном раке и др.). Наиболее полно изучено клиническое значение циркулирующих клеток у больных раком молочной железы.

В настоящее время известно, что циркулирующие опухолевые клетки в крови у больных ранним (N0) раком молочной железы обнаруживаются в 30% случаев, у больных местнораспространенным (N+) раком –в 36%, у больных метастатическим раком – в 70% случаев.

Был сделан вывод о том, что ЦОК являются прогностическими признаками раннего рецидива.

Содержание ЦОК в крови изменяется в зависимости от эффективности проводимой терапии (были изучены режимы CMF, FEC, оценена эффективность доцетаксела, тамоксифена, летрозола). Сделан вывод о том, что оценка наличия/отсутствия циркулирующих опухолевых клеток в  крови может быть использована в качестве мониторинга у больных, получающих системную химиотерапию.

Методы обнаружения циркулирующих опухолевых клеток.

В 1 мл крови единичные циркулирующие раковые клетки окружены 10 млн лейкоцитов и 5 млрд эритроцитов. Соответственно, в 10 мл крови солитарные раковые клетки смешиваются со 100 млн лейкоцитов и 50 млрд эритроцитов. Однако обнаружение и идентификация в кровотоке циркулирующих опухолевых клеток представляются очень непростой задачей не только из-за малого количества эпителиальных клеток, окруженных многочисленными клетками крови, но и из-за гетерогенности опухолевых клеток. Это обстоятельство требует использования методов идентификации, характеризующихся не только очень высокой чувствительностью, но также точностью и специфичностью.

Для поиска циркулирующих опухолевых клеток используют методы прямой или косвенной визуализации, основанные на микроскопическом анализе мембраны, цитоплазмы и ядра опухолевой клетки или же на анализе экспрессии клеткой специфических тканевых антигенов (чаще всего панцитокератинов). Современные методы молекулярной визуализации позволяют идентифицировать даже циркулирующую опухолевую ДНК и «осколки» раковых клеток. Для научных и практических целей наиболее часто используют следующие коммерческие технологии: CellSearch, Maintrac, CellPoint, Adnagen, а также RT-PCR, проточную цитофлуориметрию.

Несмотря на несомненные успехи в идентификации ЦОК, интерпретация полученных данных по-прежнему сложна и затрудняется сложностью биологии опухолевого роста. Как уже указывалось выше, на этапе интравазации опухолевая клетка теряет эпителиальные антигены и приобретает мезенхимальные (эпителиально-мезенхимальный переход). Потеря цитокератинов и эктопическая экспрессия виментина могут оказаться недостаточными для иммунной маркировки и детекции циркулирующих клеток в состоянии эпителиально-мезенхимальной трансформации. На этом этапе возможны как ложноположительные, так и ложноотрицательные заключения, а также серьезные смещения интерпретации, обусловленные инверсией фенотипа опухолевой клетки.

Сложности могут возникать и при идентификации фрагментов циркулирующих клеток, находящихся в состоянии апоптоза (апоптотических телец). Хотя фенотипически эти клетки расцениваются как злокачественные, очевидно, что колонизировать отдаленные органы и тем самым реализовать свой метастатический потенциал они не могут.

Длительное время считалось, что циркулировать в кровотоке могут только эпителиальные опухолевые клетки. В последнее время было показано, что доля цитокератинпозитивных неопухолевых клеток в крови в нормальных условиях может составлять от 0 до 20%.

Небольшое количество эпителиальных клеток было обнаружено в периферической крови пациентов с доброкачественными эпителиальными пролиферативными заболеваниями, а также у больных в случае воспаления, травмы, хирургических вмешательств. Таким образом, помимо циркулирующих опухолевых клеток, в крови могут быть циркулирующие эпителиальные клетки неопухолевой природы.

Большинство цитокератинпозитивных клеток представлены активированными лейкоцитами, которых у онкологических больных значительно больше, чем в общей популяции. Другие клетки крови (макрофаги, плазматические, ядрасодержащие гемопоэтические клетки-предшественники) также могут экспрессировать эпителиальные специфические антигены. В литературе встречается термин «циркулирующая эпителиальная клетка», что не является эквивалентом циркулирующих опухолевых клеток. Это имеет принципиальное значение, поскольку существующие высокоточные методы идентификации циркулирующих опухолевых клеток основаны не на цитологической микроскопической картине, а на выявлении цитокератинпрезентирующих клеток и других методах молекулярной идентификации.

С помощью сверхточных методов молекулярной визуализации (RT-PCR, проточной цитофлуориметрии) сегодня стало возможно выявлять даже ничтожно малое количество циркулирующих опухолевых нуклеиновых кислот в кровотоке, т. е. изучать не только клеточные, но и молекулярные механизмы метастазирования. Основным преимуществом непрямых молекулярных методов является высокая чувствительность, превышающая таковую при использовании методов иммуноцитохимии. При использовании PCR можно обнаружить одну клетку-мишень среди 106-107нормальных клеток в 0,1 мл крови.

Действительно, связь между количеством циркулирующей ДНК и количеством циркулирующих опухолевых клеток, по-видимому, существует. Однако происхождение нуклеиновых кислот в кровотоке может зависеть и от других причин: некроза клеток первичной опухоли, лизиса клеток в кровотоке, наличия клеточных фрагментов или производных экзосом, т. е. не от самого процесса эффективного метастазирования. Важным моментом, ограничивающим использование PCR при выявлении циркулирующих клеток, является то, что в процессе этапов идентификации и извлечения РНК циркулирующие клетки будут уничтожены, что делает невозможным их последующий подсчет и цитологический анализ по отдельности. Эти обстоятельства снижают клиническую ценность молекулярных технологий обнаружения циркулирующих опухолевых клеток как ведущих к гипердиагностике и ложноположительному избыточному заключению.

Несомненно: наиболее ценным и достоверным методом обнаружения циркулирующих опухолевых клеток является тот, который позволяет провести светооптическую визуализацию с изучением мембраны, цитоплазмы и ядра клетки и исключить тем самым как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты исследований. Фенотипирование и определение индивидуальных биологических характеристик клетки проводятся после ее идентификации.

Для поиска и идентификации циркулирующих опухолевых клеток используется модифицированный метод Bona и соавт. (2000), основанный на физических особенностях злокачественных клеток (их плотности и размере). Метод предполагает центрифугирование, цитаферез, седиментацию, дезагрегацию и микрофильтрацию клеток через полиуретановый фильтр с диаметром пор до 30 мкм. После обогащения клеточного состава выполняются микроскопия и фенотипирование опухолевых клеток.

Таким образом, наличие циркулирующих опухолевых клеток в крови свидетельствует о приобретении опухолью принципиально новых качеств – инвазивности и способности к метастазированию. Несомненно, что циркулирующие опухолевые клетки не только являются ключом к пониманию биологии метастазов, но также представляют собой прогностический и предиктивный онкомаркер нового поколения, отражающий эффективность противоопухолевого лечения. Клинические онкологи нуждаются в доступности подобных технологий для ежедневного использования.