Техника FISH — Fluorescent in situ hybridization, разработана в середине 1980-х годов и используется для детекции присутствия или отсутствия специфических ДНК-последовательностей на хромосомах, а также альфа-сателлита ДНК, локализованного на центромере хромосомы 6, CEP6(6р11.1-q11.1).
Это дало существенный сдвиг в диагностике онкологических заболеваний меланоцитарного генеза произошел в связи с обнаружением опухолевых антигенов. На фоне злокачественной меланомы определяется мутация в трех антигенах: CDK2NA (9p21), CDK4 (12q14) и CMM1(1p). В связи с этим возможность объективной дифференциальной диагностики, основанной на определении генетических характеристик меланоцитарных опухолей кожи, имеет большое значение в ранней диагностике меланомы и ее предшественников.В ядре с нормальным набором исследуемых генов и хромосомы 6 наблюдается два гена RREB1, окрашенных красным, два гена MYB, окрашенных желтым, два гена CCND1, выделенных зеленым цветом, и две центромеры хромосомы 6, обозначенные голубым цветом. С диагностической целью используются флуоресцентные пробы.
Оценка результатов реакции: проводится подсчет количества красного, желтого, зеленого и голубого сигналов в 30 ядрах каждого образца, выявляются четыре параметра различных вариантов генетических нарушений, при которых образец генетически соответствует меланоме. Например, образец соответствует меланоме, если среднее количество гена CCND1 на ядро ≥2,5. По этому же принципу производится оценка копийности других генов. Препарат считается FISH-положительным, если выполняется хотя бы одно из четырех условий. Образцы, в которых все четыре параметра ниже пограничных значений, расцениваются как FISH-отрицательные.
Определение специфических ДНК-последовательностей на хромосомах проводят на гистологических срезах биоптатов или операционного материала. В практическом исполнении FISH-реакция выглядит следующим образом: исследуемый материал, содержащий ДНК в ядрах меланоцитов, подвергается обработке для частичного разрушения ее молекулы с целью разрыва двухцепочной структуры и тем самым облегчения доступа к искомому участку гена. Пробы классифицируются по месту присоединения к молекуле ДНК. Материалом для FISH-реакции в клинической практике служат парафиновые срезы тканей, мазки и отпечатки.
FISH-реакция позволяет находить изменения, произошедшие в молекуле ДНК в результате увеличения числа копий гена, потери гена, изменения числа хромосом и качественных изменений — перемещения локусов генов как в одной и той же хромосоме, так и между двумя хромосомами.
Для обработки полученных данных при применении FISH-реакции и изучения зависимости между копийностью генов трех исследумых групп используется коэффициент корреляции Спирмена.
Для меланомы характерно увеличение копийности по сравнению с невусом и диспластическим невусом.
Простой невус по сравнению с диспластическим невусом имеет меньше нарушений в копийности (т.е. больше нормальных копийностей).
Для построения решающих правил, позволяющих предсказать, относится ли образец к тому или иному классу (дифференциальная диагностика простых и диспластических невусов), используется математический аппарат «деревьев решений» (decision trees). Данный подход хорошо зарекомендовал себя на практике, а результаты применения указанного метода (в отличие от многих других методов, например нейронных сетей) могут быть наглядно интерпретированы для построения решающих правил для дифференциации простого, диспластического невусов и меланомы. Исходными данными во всех случаях являлись копийности четырех генов.
Задачу по построению решающего правила для дифференциальной диагностики разбивают на несколько этапов. На первом этапе дифференцируют меланому и невус, не учитывая тип невуса. На следующем этапе строят решающее правило для разделения простого и диспластического невусов. Наконец на последнем этапе возможно построение «дерева решений» для определения степени дисплазии диспластического невуса.
Подобное разделение задачи классификации невусов на подзадачи позволяет достичь высокой точности предсказаний на каждом из этапов. Входными данными для построения «дерева решений» служат данные о копийности четырех генов для пациентов с диагнозом «меланома» и пациентов с диагнозом «не меланома» (пациенты с различными типами невуса — простым и диспластическим). Для каждого пациента имеются данные о копийности генов для 30 клеток.
Таким образом, разделение задачи предсказания диагноза на несколько этапов позволяет строить высокоточные решающие правила не только для дифференцирования между меланомой и невусами, но и для определения типа невусов и предсказания степени дисплазии для диспластического невуса. Построенные «деревья решений» являются наглядным способом предсказания диагноза по сведениям о копийностях генов и легко могут быть использованы в клинической практике при дифференциации доброкачественных, предзлокачественных и злокачественных меланоцитарных новообразований кожи. Предлагаемый дополнительный метод дифференциальной диагностики особенно важен при иссечении гигантских врожденных пигментных невусов и диспластических невусов у пациентов детского возраста, поскольку при обращении таких пациентов в медицинские учреждения отмечается высокий процент диагностических ошибок. Результаты использования описанного метода высокоэффективны, целесообразно его использовать при диагностике пигментных опухолей кожи, особенно у пациентов с FAMM-cиндромом.