Опухолевые стволовые клетки

Определения

Мезенхимальная стволовая клетка (МСК) – стволовая клетка, способная образовывать любые клетки мезенхимального происхождения
Метастатическая ОСК (мОСК) — ОСК, способная к миграции и образованию метастазов.
Мультипотентная мезенхимальная стволовая клетка (ММСК) – стволовая клетка, способная образовывать любые клетки мезенхимального и немезенхимального происхождения.
Опухолевая стволовая клетка (ОСК) – специфическая опухолевая клетка – долгоживущая и медленно пролиферирующая, способная при трансплантации иммунодефицитным животным in vivo индуцировать рост опухоли, идентичной исходной, в то время как другие короткоживущие и более дифференцированные клетки опухоли этой способностью не обладают. Опухолевые стволовые клетки обладает способностью к самовоспроизведению (репопуляции) и асинхронному делению, когда одна дочерняя клетка сохраняет свойства ОСК, а вторая – является коммитированной к дифференцировке в определенном направлении и способна быстро пролиферировать, но способность к дифференцировке у ее потомков изменена
Побочная популяция – см. «Side population».
Прогениторные клетки – быстро пролиферирующие клетки, ближайшие потомки стволовых клеток, получившие стимул к дифференцировке в определенном направлении.
Side population (SP), побочная популяция, – популяция клеток, характеризующаяся отсутствием или низкой интенсивностью флуоресценции при исследовании с помощью проточной цитофлуориметрии при окрашивании клеток липофильными флуоресцентными красителями Хехст 33342 или родамин-123. В зону SP попадают СК.

Глубокий интерес человечества к созданию новых методов регенеративной медицины с использованием клеточных технологий – один из стимулов того бурного развития исследований, которое наблюдается в области изучения биологии и свойств стволовых клеток (СК) человека. Осознание свойств эмбриональных СК и СК нормальных тканей взрослых привело к открытию опухолевых СК (ОСК) и позволило сформулировать новые представления о закономерностях развития опухолей и способах их терапии, исходя из сведений о существовании ОСК.

1. Опухолевые стволовые клетки – определения, теория, доказательстваСтроение и клеточная масса различных органов в норме поддерживается присутствием регионарных СК, которые обеспечивают процессы постепенного обновления тканей и их регенерацию в случае повреждения. Регионарные СК представлены в органах очень небольшой фракцией и характеризуются тремя основными признаками: 1) способностью к самообновлению, или репопуляции, т.е. к воспроизведению новых СК с такой же способностью к пролиферации, размножению и дифференцировке, как исходные СК, что обеспечивает сохранение пула СК; 2) способностью к асимметричному делению, в результате которого происходит и воспроизведение СК, и образование коммитированных к дифференцировке в нужном направлении дочерних клеток – прогениторных клеток (ПК), — обеспечивающих ткань постоянно возобновляемыми зрелыми элементами с ограниченной продолжительностью существования; 3) способностью регулировать соотношение процессов образования более дифференцированных клеток-потомков, восполняющих ткань, и самообновления СК в соответствии с конкретной ситуацией в ткани, включая случаи ее повреждения.

При изучении особенностей различных соматических СК — кроветворных, нейральных и СК эпителия молочной железы — удалось идентифицировать комбинации специфических маркеров, характеризующих фенотип отдельных типов соматических СК человека. Так маркерами кроветворной СК являются такие молекулы клеточной поверхности, как CD34+, CD38-, Thy1-, Lin- , СК мозга — CD133+Lin- , предстательной железы – CD133+ a2?1hi .

Кроме того, уже в ранних исследованиях, касавшихся изучения свойств кроветворных СК мышей, была обнаружена их способность «выплевывать», выбрасывать из цитоплазмы определенные липофильные флуоресцентные красители, такие, как Хехст (Hoechst) 33342 или родамин-123. Эта особенность позволяет не только идентифицировать СК при проточной цитофлуориметрии, но и собирать их для различных исследований как фракцию неокрашенных или слабоокрашенных клеток с помощью цитофлуориметров-сортировщиков клеток.

При использовании этого метода клетки инкубируют с флуоресцентным красителем Хехст 33342, а затем с помощью проточной цитофлуориметрии исследуют интенсивность флуоресценции клеток в красной и синей области спектра для идентификации популяции клеток, характеризующейся низкой интенсивностью флуоресценции . Такие неокрашивающиеся или слабо окрашивающиеся клетки обычно присутствуют в очень небольшом количестве и поэтому получили название побочной популяции – side-population (SP).

Позднее было обнаружено, что СК не только кроветворных, но и других тканей также образуют SP , а активность выброса красителей коррелирует со стадией зрелости их дочерних клеток. При этом наиболее примитивные клетки характеризовались наиболее активным выбросом . Способность СК выбрасывать липофильные флуоресцентные красители из цитоплазмы и образовывать SP часто рассматривают как суррогатный маркер СК.

Экспериментальное изучение опухолевых стволовых клеток человека in vivo стало возможным только после того, как были созданы специальные модели для развития опухолей человека у животных. Для проведения таких исследований используют иммунодефицитных мышей линии SCID (severe combined immunodeficiency mouse – мыши с тяжелой иммунологической недостаточностью, иммунодефицит определяется отсутствием Т- и В- лимфоцитов) и, особенно часто, мышей линии NOD-SCID (Nonobese Diabetic SCID – мыши SCID с диабетом без ожирения, иммунодефицит характеризуется отсутствием T-, B- и NK-лимфоцитов). Отсутствие иммунной системы у таких мышей позволяет успешно прививать им опухолевые клетки человека, из которых у этих животных развиваются ксеногенные опухоли . Поэтому доказательством присутствия лпухолевых стволовых клеток среди изучаемых популяций клеток человека является их способность индуцировать опухоли после прививки иммунодефицитным животным. Следует отметить, что в таких экспериментах, кроме того, часто используются гуманизированные модели, когда животным вместе с опухолевыми клетками вводят облученные фибробласты человека, обеспечивающие секрецию ростовых факторов, необходимых для жизнеобеспечения и пролиферации ОСК человека.

При проведении подобных исследований из опухолевой ткани готовят суспензию исходных клеток и их отдельных субпопуляций, которые выделяют с помощью фракционирования исходной суспензии, основываясь либо на выбранных маркерах клеточной поверхности, например, CD133+ клетки, либо на выбранных свойствах клеток, например, на их способности не включать флуоресцентные красители. Выделенные субпопуляции, обогащенные исследуемыми типами клеток, вводят в подходящие ткани иммунодефицитных мышей и анализируют их способность образовывать опухоли. В соответствии с представлениями об ОСК, опухоли будут индуцироваться только в том случае, если в изучаемой популяции клеток будут присутствовать опухолевые стволовые клетки. Выявление в исследуемом материале клеток, способных индуцировать in vivo новые опухоли, идентичные исходной по гистологической характеристике, свидетельствует о присутствии ОСК.

Первые представления о связи происхождения опухолевых клеток со СК были получены при изучении хронического миелолейкоза. При этом заболевании у большинства больных в опухолевых клетках обнаруживается специфическая аберрация хромосом , получившая название филадельфийской хромосомы. Эта аномалия приводит к укорочению длинного плеча хромосомы 22. Утраченный участок хромосомы 22 в большинстве случаев соединяется с хромосомой 9, а фрагмент хромосомы 9 соединяется с хромосомой 22.

При хроническом миелолейкозе филадельфийская хромосома была обнаружена в метафазе всех делящихся клеток всех трех ростков костного мозга и клеток периферической крови во всех стадиях болезни, включая период клинической и гематологической ремиссии, что позволило высказать предположение о том, что эта аберрация возникает в кроветворных СК. Первые доказательства справедливости этого предположения были получены группой P.J. Fialkow и соавторов с использованием цитогенетических методов . Позднее представленные ими данные были подтверждены в исследованиях с использованием проточной цитофлуориметрии .

Первые доказательства существования ОСК были получены также при исследовании злокачественных заболеваний кроветворной системы. Впервые опухолевые стволовые клетки выделены и охарактеризованы Y.E.Dick и соавторами в 1997 году при исследовании острого миелолейкоза . В результате 20-летних исследований, с использованием модели иммунодефицитных мышей NOD-SCID, этой группой сотрудников было обнаружено, что миелолейкоз человека переносит лишь небольшая часть клеток со свойствами ОСК.

Эти клетки были охарактеризованы по поверхностным антигенам как CD34+/CD38-. В общей популяции опухолевых клеток доля клеток с таким фенотипом составляла лишь 0,1 %, но именно эти клетки при введении NOD/SCID мышам размножались и дифференцировались с образованием лейкозных клеток разных типов (разной стадии дифференцировки), соответствующих исходному лейкозу. В тоже время введение NOD/SCID мышам опухолевых клеток с другим фенотипом к развитию заболевания не приводило. Таким образом, опухолевые клетки CD34+/CD38- обладали всеми уникальными свойствами, присущим нормальным кроветворным СК. Это и позволило позднее назвать опухолевые клетки с такими особенностями ОСК и сформулировать гипотезу о роли опухолевых стволовых клеток в развитии рака .

Спустя шесть лет, в 2003 году при использовании той же методологии M. Al-Hajj и соавторами впервые, на примере рака молочной железы, было доказано существование опухолевых стволовых клеток в солидных опухолях . В этом исследовании, также как ранее в работе Y.E. Dick для клеток миелолейкоза, было показано, что только клетки с определенным фенотипом – CD44+ CD24-/low ESA+ (ESA — epithelial-specific antigen – специфический для эпителиальных клеток антиген) — были способны индуцировать рак молочной железы человека у иммунодефицитных мышей. При этом развитие опухоли наблюдали при введении лишь 200 таких клеток, в то время как введение даже нескольких десятков тысяч клеток рака молочной железы, не обладающих таким фенотипом, не индуцировало развитие опухоли. Для убедительности экспериментов авторы вводили эти два типа клеток одной и той же мыши (в разные области).

С использованием этого подхода были получены убедительные доказательства присутствия опухолевых стволовых клеток для большого числа солидных опухолей человека . В таблице 1 приведены данные о типах солидных опухолей, в которых доказано присутствие опухолевых стволовых клеток, и о маркерах, которые были идентифицированы для epithelial-specific antigen – специфический для эпителиальных клеток антиген соответствующих ОСК.

Необходимо подчеркнуть сходство маркеров опухолевых стволовых клеток и названных выше маркеров соответствующих нормальных соматических СК.

Следует отметить также, что опухолевые стволовые клетки разного происхождения при исследовании с флуоресцентными красителями Хехст 33342 и родамин-123, как и нормальные СК, обладают способностью исключать эти липофильные красители из клеток и образовывать SP .

Исследования различных опухолей человека, проведенные с использованием описанного подхода в разных исследовательских центрах, позволили сделать следующие важные выводы.

1) В каждой опухоли присутствует лишь очень небольшая доля опухолевых стволовых клеток, то есть клеток, способных индуцировать опухоли человека при введении иммунодефицитным мышам.

2) опухолевые стволовые клетки имеют определенные поверхностные маркеры, что позволяет успешно и воспроизводимо выделять их из общей массы опухолевых клеток с помощью проточной цитофлуориметрии или с помощью различных вариантов иммуноселекции.

3) Опухоли, развивающиеся из опухолевых стволовых клеток, содержат смешанную популяцию туморогенных и не туморогенных клеток, соответствующую гетерогенному клеточному составу исходной опухоли.

Следует отметить, что многие авторы с осторожностью относятся к термину опухолевые стволовые клетки и предпочитают оперировать понятием туморогенных или опухоль-индуцирующих клеток (tumor-initiating cells – туморогенные клетки).

Несмотря на это, в настоящее время понятие опухолевых стволовых клеток становится общепринятым и обсуждая эту проблему, P. Dalerda и соавторы справедливо подчеркивают, что термин «опухолевые стволовые клетки» является рабочим понятием и используется именно для определения клеток, способных инициировать опухоль, аналогичную по клеточному составу той опухолевой ткани, из которой они были получены.

2. Происхождение опухолевых стволовых клеток

В основе учения об опухолевых стволовых клеток, как следует из рассмотренных выше сведений, лежат современные представления о природе нормальных соматических СК.

Эмбриональные СК называют тотипотентными, т.к. они способны образовывать клетки любого из трех типов эмбриональных зародышевых слоев — эктодермы, мезодермы и эндодермы. До недавнего времени было принято считать, что СК взрослых, в отличие от эмбриональных, способны образовывать субпопуляции только тех клеток, которые имеют общее происхождение в процессе эмбриогенеза, а их дифференцировка и регенеративный потенциал определяются под влиянием микроокружения в той ткан, в которой они оседают. В настоящее время эти представления пересматриваются, т.к. оказалось, что тканеспецифические соматические СК взрослых обладают гораздо большей пластичностью, чем предполагалось ранее. Прежде всего, это положение относится к СК костного мозга. Кроветворные СК костного мозга способны дифференцироваться не только в любые зрелые кроветворные клетки, но и в некоторые другие типы клеток – нервные клетки, клетки печени, поджелудочной железы, миокарда, эпителия, кожи, и др. Мезенхимальные СК (МСК) костного мозга также способны дифференцироваться в клетки тканей, имеющих различное эмбриональное происхождение . В последние годы предложено называть такие клетки мультипотентными стромальными СК (ММСК). S. Sell даже постулирует, что тканевые СК по своей полипотентности равноценны покоящимся эмбриональным СК .

Для объяснения пластичности СК взрослых допускают возможность функционирования двух механизмов. Первый получил название трансдифференцировки, т.е. способности тканевой СК одной специфичности дифференцироваться в клетки иной специфичности. Это положение важно для понимания явления пластичности СК, т.к. оно подчеркивает возможность выбора направления дифференцировки СК в зависимости от факторов микроокружения.

Другой механизм, определяющий пластичность СК, как полагают, может быть связан со слиянием СК и дифференцированных тканевых клеток с образованием гибридных клеток, приобретающих свойства СК новой специфичности, определяемой дифференцированной тканевой клеткой .

Явление слияния кроветворных СК и МСК с клетками различных тканей получило экспериментальное подтверждение . Не останавливаясь на пока еще мало изученных и во многом гипотетических молекулярных механизмах этого процесса, рассмотрим связь этих особенностей биологии СК с формированием ОСК.

Анализируя возможные пути возникновения опухолевых стволовых клеток, разные авторы склоняются к существованию трех возможных механизмов . Первый предполагает возникновение ОСК из нормальной соматической СК в результате накопления мутаций. Второй механизм допускает, что в прогениторной, или даже в дифференцированной клетке могут возникнуть онкогенные мутации, в результате которых клетка вновь обретает способность к самообновлению, т. е. восстанавливает свойства СК, и становится злокачественной. Третий механизм связан с возможностью возникновения опухолевых стволовых клеток в результате слияния СК с дифференцированной клеткой с образованием гибридных клеток со свойствами опухолевых стволовых клеток или способных становиться ОСК в дальнейшем.

Мутации могут возникнуть в стволовой, дифференцированной или гибридной клетке.

Рассматривая судьбу гибридной клетки, образующейся в результате слияния нормальных клеток, можно полагать, что в результате слияния повышается вероятность генетической нестабильности гибридной клетки, из которой далее может образовываться клетка со свойствами опухолевых стволовых клеток. Экспериментальные результаты, подтверждающие эти представления, были получены при изучении слияния клеток человека под действием вирусов приматов: в результате слияния появлялись пролиферирующие трансформированные клетки .

Опухолевые стволовые клетки может возникать и в том случае, если слияние происходит между мутантной СК и нормальной дифференцированной клеткой и наоборот.

Таким образом, при формировании ОСК в результате слияния СК и соматической клетки, мутации, определяющие возникновение опухолевых стволовых клеток, могут появляться как в нормальной СК, так и в соматической дифференцированной клетке. Кроме того, мутации могут возникнуть и уже в новой гибридной клетке, после завершения слияния.

Процесс слияния клеток может регулироваться с участием одного из АВС транспортеров — АВСВ5 . Показано, что этот белок регулирует мембранный потенциал в клетках, ведущих свое происхождение из меланоцитов кожи и характеризующихся фенотипом опухолевых стволовых клеток (CD133+). Эффективность слияния повышалась при блокировании АВСВ5 с помощью моноклональных антител к этому белку. Оказалось, что гликопротеин АВСВ5 регулирует мембранный потенциал в тех клетках, которые готовятся к слиянию. В результате слияния сначала образовывались полиплоидные многоядерные гибридные клетки, а уже затем они давали потомство одноядерных клеток. Авторы на основе своих исследований приходят к выводу о том, что слияние клеток – не спонтанный, а регулируемый процесс, который контролируется гликопротеином АВСВ5. Известны и другие белки, регулирующие процесс слияния клеток.

Многие опухолевые клетки обладают повышенной способность к слиянию и показано, что гибридные клетки, образующиеся при слиянии опухолевых и нормальных клеток, могут отличаться большей злокачественностью, чем исходные .

Отмеченное ранее сходство поверхностных маркеров соматических СК нормальных тканей и опухолевых стволовых клеток свидетельствует о том, что ОСК либо возникают в результате накопления мутаций именно в СК, либо мутации, в результате которых возникают ОСК, неизбежно приводят к формированию у ОСК фенотипа, близкого к нормальной СК.

В настоящее время пока невозможно установить непосредственную связь между опухолевыми стволовыми клетками конкретной опухоли и той нормальной СК, из которой она возникла. В тоже время важно отметить, что повреждение генома полипотентных СК костного мозга может приводить к образованию опухолевых клеток различных типов . Эти данные свидетельствуют о том, что из трансформированных СК костного мозга могут вести свое происхождение мультипотентные опухолевые стволовые клеток.

3. Особенности опухолевых стволовых клеток, определяющие устойчивость опухоли к химиотерапевтическим препаратам

Опухолевые стволовые клетки сохраняют многие свойства нормальных СК, в том числе те, которые делают СК устойчивой ко внешним воздействиям. Для нормальной СК это большая продолжительность жизни в состоянии покоя, экспрессия нескольких типов АТФ-зависимых транспортеров (АТР-binding cassette, или АВС-transporters), обеспечивающих устойчивость к цитотоксическим препаратам и токсинам, высокая способность к репарации ДНК, и устойчивость к апоптозу.  Используя энергию гидролиза АТФ, эти транспортеры выводят липофильные, в том числе многие токсичные, вещества из клеток.

Представления о происхождении опухолевых стволовых клеток из нормальных СК привели к предположению о том, что ОСК сохранили присущие нормальным СК механизмы устойчивости к повреждающим воздействиям.

В опухолевых клетках обнаружены гены ABCG2, ABCB1 и АВСС1, кодирующие белки, которые осуществляют транспорт как гидрофобных, так и гидрофильных соединений из клеток в среду , и именно они обеспечивают выброс красителей Хехста и родамина, что, как отмечено выше позволяет идентифицировать клетки, составляющие SP.

В зону SP попадает большая фракция кроветворных СК . Клетки, формирующие SP, как уже было отмечено, удается выделить из различных тканей, включая мозг, молочную железу, легкие, сердце, поджелудочную железу, семенники, кожу, печень, где они, по-видимому, соответствуют тканеспецифическим соматическим СК .

После того, как было установлено, что СК обнаруживаются в основном во фракции SP, стало возможным выделять СК с помощью сортировки с использованием проточных цитофлуориметров практически из любых тканей или из культур клеток . Этот подход был использован для идентификации опухолевых стволовых клеток в опухолях различных типов и в длительно культивируемых линиях опухолевых клеток человека. Действительно, по способности клеток выбрасывать Хехст 33342 среди опухолевых клеток была обнаружена SP в 15 из 23 образцов нейробластом . При этом клетки SP были способны пролиферировать in vitro, делились асимметрично, т.к. в результате пролиферации потомство клеток SP содержало как клетки, образующие SP, так и клетки не относящиеся к SP.

В клетках SP различных нейробластом обнаружен высокий уровень экспрессии генов АВС-транспортеров АВСG2 и АВСА3 . В этом же исследовании показано, что SP выявляется в культивируемых клетках различных линий опухолевых клеток человека – рака молочной железы, легкого, яичников, саркомы, глиобластомы. SP обнаружена также среди клеток назо-фарингеальной карциномы , гепатоклеточной карциномы и некоторых других опухолевых линий , что свидетельствует об очень длительном существовании опухолевых стволовых клеток в культурах опухолевых клеток человека.

В экспериментах, выполненных на клетках аденокарциномы предстательной железы и молочной железы, в клетках SP обнаруживается повышенный уровень экспрессии транспортера ABCG2 по сравнению с не SP клетками . В то же время ABCG2+ клетки и ABCG2- клетки обладают близкой способностью индуцировать новые опухоли. Кроме того, в потомстве ABCG2+ клеток появлялись ABCG2- клетки и наоборот. При клональном анализе оказалось, что популяция ABCG2+ образует большее число колоний и колонии были большего размера, что экспрессия ABCG2+ в SP присуща быстро пролиферирующим прогениторным опухолевым клеткам, а популяция ABCG2- содержит примитивные ОСК.

Транспортер ABCB1 принадлежит суперсемейству активных транспортеров, обнаруженных не только в эукариотических, но и в прокариотических клетках . Этот транспортер действует как выкачивающий насос в отношении широкого спектра низкомолекулярных веществ и участвует в обеспечении процессов трансмембранного транспорта таких физиологически активных веществ, как липиды и фосфолипиды , ИЛ-2 , ИЛ-4 и ИФ.

Транспортеры АВСВ1, АВСС1 и АВСG2 определяют феномен множественной лекарственной устойчивости. Эти транспортеры незначительно различаются по специфичности в отношении выбрасываемых субстратов.

АВСВ5 – новый, недавно открытый транспортер – обеспечивает, как и АВСВ1, АТФ-зависимый выброс флуоресцентного красителя родамин-123 из клеток и обнаруживается в СD133+-клетках среди опухолевых клеток из эпидермальных меланоцитов человека и в клетках злокачественной меланомы человека лини G3361 , которая имела следующий фенотип: ABCB5+, MelanA+CD29+CD44+CD49+CD133+CD166+. Наиболее высокий уровень экспрессии этих маркеров наблюдался в опухолевых клетках в метастазах, обнаруженных в лимфоузлах.

В прогениторных клетках транспортер АВСВ5 , но не АВСВ1 , поддерживает гиперполяризацию мембраны, препятствуя тем самым слиянию клеток, росту культуры и дифференцировке клеток. В клетках злокачественной меланомы транспортер АВСВ5 определяет механизм устойчивости к доксорубицину . Более того, транспортер ABCB5 оказался новым молекулярным маркером резистентной субпопуляции клеток как первичной меланомы с фенотипом СК, так и ее метастазов. Устойчивость этих клеток удавалось снижать, блокируя ABCB5 с помощью специфических антител.

Таким образом, устойчивость опухолей ко многим типам противоопухолевых препаратов определяется тем, что именно опухолевые стволовые клетки сохраняют высокую устойчивость, присущую нормальным СК, благодаря активной экспрессии генов белков-транспортеров, обеспечивающих выброс цитотоксических лекарств из клетки. Относительная устойчивость опухоли в целом и длительность ремиссии в значительной мере будет определяться величиной доли резистентных опухолевых стволовых клеток в опухоли.

4. Опухолевые стволовые клетки и происхождение метастазов.

При злокачественных новообразованиях 90 % смертей связано с образованием метастазов, т.е. с распространением опухолевых клеток из первичной опухоли в отдаленные от места первичного очага органы и ткани. Открытие опухолевых стволовых клеток и новое понимание процессов канцерогенеза и опухолевой прогрессии в свете свойств ОСК ставит новые вопросы и в осознании связи опухолевых стволовых клеток с метастатическим процессом. F. Li и соавторы предполагают, что способность опухоли образовывать метастазы может определяться особенностями одной из субпопуляций ОСК, которую они назвали метастатической опухолевой стволовой клеткой (мОСК) . При этом способность к образованию метастазов мОСК реализуется при взаимодействии мОСК с тем микроокружением, или нишей, в которой оказывается мОСК.

Понятие ниши СК было сформулировано в 1978 г. R. Schofield, как физиологическое микроокружение, поддерживающее и обеспечивающее существование СК . У человека ниши СК взрослых охарактеризованы в костном мозге, коже, волосяном фолликуле, кишечнике, нервной системе и в семенниках . Эти ниши различаются по клеточному составу и строению, но они могут являться одновременно и нишами для опухолевых стволовых клеток, и именно такие ниши могут определять процессы метастазирования в отдельные органы.

Клетки ниши секретируют факторы, регулирующие баланс между пролиферацией и дифференцировкой СК, а также факторы, обеспечивающие удержание («заякоревание») СК в ее нише. Так, например, кроветворная СК прикрепляется к остеобластам в костном мозге с помощью образования между мембранами клеток комплекса N-кадгерин-катенин . Важную роль в этих взаимодействиях играют такие белки, как остеопонтин и интегрины , хемокин SDF-1, секретируемый стромальными клетками, и его рецептор CXCR4 . Эти же факторы играют важную роль в развитии процесса формирования метастазов .

В исследованиях последних лет обнаружено, что способность к метастазированию предопределяется в результате генетических изменений, возникающих уже на ранних этапах развития опухоли . При использовании генетических методов удалось идентифицировать набор молекулярных особенностей, которые свидетельствуют о высокой способности солидной опухоли к метастазированию . Если окажется, что экспрессия генов, характерных для тканеспецифических метастазов, будет сходной с экспрессией генов, характерных для опухолевых стволовых клеток, то это будет свидетельством присутствия мОСК в опухоли.

Если в опухоли только опухолевые стволовые клетки способны инициировать и поддерживать опухолевый рост, то именно ОСК должна быть и мОСК, т.к. не стволовые клетки опухоли не будут способны формировать новые опухоли в других местах организма. В процессе формирования пула ОСК, СК приобретает уникальный набор генетических изменений, которые предопределяют ее злокачественность, метастатический потенциал и тканевой тропизм.

Между первичной опухолью и потенциальной нишей для образования метастазов осуществляется «молекулярный диалог» с участием секреции стимулирующих сигналов, которые помогают обеспечить хоминг мОСК. Путь мОСК в предпочтительные ткани и органы контролируется градиентом концентрации различных хемоатрактантов, секретируемых клетками ниши .

Клетки стромы опухоли составляют 60-90 % от массы опухоли, причем важно отметить, что клетки стромы происходят из костного мозга . Эти клетки выполняют важнейшие функции в обеспечении жизнедеятельности опухолевых клеток. Основным компонентом стромы являются миофибробласты. Важно подчеркнуть, что эти же клетки участвуют в формировании ниши СК в костном мозге и других органах . Клетки стромы, как и клетки, формирующие ниши СК, секретируют различные факторы роста и хемокины . Клетки стромы наряду с опухолевыми клетками и клетками воспалительного инфильтрата секретируют факторы, стимулирующие мобилизацию из костного мозга предшественников эндотелиальных клеток и их миграцию в зону опухоли для обеспечения развития ее сосудистой сети.

Опухолевые стволовые клетки в первичном опухолевом очаге и мОСК во вторичных местах локализации метастазов, либо захватывают ниши нормальных СК, либо рекрутируют дополнительные компоненты, например, клетки костного мозга для формирования адекватной ниши .

В новом очаге мОСК могут либо активно пролиферировать, либо оставаться в состоянии покоя (так называемые дормантные ОСК). Исходящие от клеток ниши стимулирующие факторы могут реактивировать ОСК и приводить к формированию метастатического очага .

Описанная модель, предложенная F. Li и соавторами , объясняет временные особенности возникновения первичных и вторичных опухолей. В зоне метастазирования мОСК реализует те же генетические программы, что и в первичном очаге, путем самообновления, и это объясняет фенотипическое сходство первичного рака и метастазов.

В то же время во вторичных очагах мОСК могут приобретать новые свойства в результате накопления дополнительных генетических изменений, делающих их устойчивыми к тем медикаментозным средствам, которые были эффективны в отношении первичной опухоли.

Изложенная модель позволяет авторам придти к выводу о необходимости превентивных мер, направленных на борьбу с метастазами, которые должны использоваться значительно раньше, чем это делается в настоящее время, и использовать при выборе мишени терапии свойства мОСК.

5. Роль нарушений в белках сигнальных путей, регулирующих активность стволовых клеток, в происхождении опухолей и опухолевых стволовых клеток.

Совокупность результатов экспериментального изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе стимуляции пролиферации и дифференцировки СК, позволяет полагать, что регуляция этих процессов в ОСК, по-видимому, находится под контролем тех же сигнальных путей, что и в нормальных СК — Hedgehog (Hh), Notch и Wnt .

В динамике развития эмбриона регуляция многих процессов также осуществляются с участием сигнальных путей Hh, Notch, и Wnt. Эти же пути играют ключевую роль, как становится понятно теперь, в канцерогенезе, если происходит их активация в СК или реактивация в дифференцированных.

Сигнальный путь Hedgehog

У млекопитающих обнаружено три гликопептида, являющихся членами семейства белков, получивших название Hedgehog (Hh). Это Sonic (Shh), Indian (Ihh) и Desert (Dhh). В таблице 3 приведены основные компоненты сигнальной системы Hh и их функции.

Взаимодействие белков Hh с рецептором PTCH 1 приводит к активации факторов транскрипции Gli. На этом пути передачи сигнала участвуют еще 2 белка: клеточный трансмембранный рецептор smoothened (SMOH) и цитоплазматический белок SUFU. При отсутствии связывания РТСН 1 с лигандом Hh, РТСН 1 ингибирует активность рецептора SMOH, выбрасывая активирующий SMOH лиганд из клетки. При взаимодействии лиганда Hh с рецептором РТСН 1, SMOH встраивается в плазматическую мембрану клетки и беспрепятственно связывается со своим лигандом. В результате отменяется ингибирующий сигнал и из репрессорного комплекса, в котором белок SUFU связывает и блокирует фактор транскрипции Gli, происходит высвобождение активного регулятора транскрипции GliA. Он транслоцируется в ядро и активирует транскрипцию Hh-зависимых генов, в том числе и РТСН 1, Gli1 и Bmi-1, а также теломеразы , циклинов и циклин-зависимых киназ .

Основные компоненты сигнальной системы Hh и их функции .

PTCH 1
Трансмембранный рецептор белков Hh, содержит 12 трансмембранных доменов. В отсутствии белков Hh осуществляет выброс из клетки эндогенного лиганда, способного связываться с белком SMOH.

SMOH
Трансмембранный рецептор, содержит 7 трансмембранных доменов. В отсутствии белков Hh мембранные везикулы с белком SMOH локализованы в цитоплазме.

SUFU
Ингибитор транскрипционного комплекса, формируемого белками семейства Gli в цитоплазме.

Gli1, Gli2, Gli3

Белки, формирующие транскрипционный комплекс, который регулирует активность Hh-зависимых генов, в первую очередь PTCH 1, Gli1 и Bmi-1.

У взрослых активность сигнальной системы Hh очень сильно снижена по сравнению со стадией эмбрионального и неонатального развития (данные получены на мышах) и обнаруживается лишь в нейральных СК ЦНС и в эпителии кишечника .

При медулобластоме более чем в 30 % случаев обнаружена активация сигнальной системы Hh в результате мутаций в гене РТСН 1 или SUFU .

При базально-клеточной карциноме в большинстве случаев также обнаруживается гиперактивация этой сигнальной системы в результате повышения уровня мРНК генов Gli1 и РТСН 1 в опухолевых клетках или появления инактивирующих мутаций в гене РТСH 1 и активирующих мутаций в гене SMOH .

Эти данные заставили искать для лечения таких опухолей низкомолекулярные ингибиторы системы Hh. Наиболее известный препарат, ингибирующий систему Hh (ингибитор SMOH) – циклопамин (cyclopamine) – был получен из полевого вьюнка . Синтетический препарат аминопролин Cur-61414 связывает SMOH и ингибирует систему Hh и обладает противоопухолевой активностью при базально-клеточной карциноме в модельных экспериментах на мышах . В экспериментальных исследованиях обнаружена также высокая противоопухолевая активность ингибиторов сигнальной системы Hh при медулобластоме, опухолях головного мозга и раке предстательной железы .

Сигнальный путь Notch

Notch – сигнальный путь, который контролирует и регулирует свойства СК и инициацию дифференцировки в эмбриональном и постнатальном развитии У млекопитающих известна экспрессия 4-х генов (NOTCH 1-4).

Лиганды и рецепторы Notch являются трансмембранными белками I типа. Рецепторы Notch встроены в мембрану клетки в виде гетеродимеров с одним трансмембранным доменом. Их экстраклеточные домены содержат от 29 до 36 повторов, аналогичных ЭФР, и связывают специфические лиганды (Delta, Serrate, Lag-2) на поверхности соседних клеток, а цитоплазматические домены участвуют в формировании сигнала, передаваемого в ядро клетки. При связывании с лигандом рецептор Notch разрывается металлопротеиназой или ?-секретазой в области трансмембранного домена и внутриклеточный домен транслоцируется в ядро, где он участвует в формировании энхансосомы и активации транскрипции соответствующих генов–мишеней.

Одним из результатов активации этого сигнального пути является сохранение в дифференцированной ткани небольшой доли некоммитированных мультипотентных клеток . Этот сигнальный путь поддерживает пролиферацию СК и ингибирует дифференцировку нейральных СК и эмбриональных опухолей мозга, возникающих из этих клеток, в частности медулобластомы .

Фармакологические ингибиторы ?-секретазы вызывали блокаду сигнальной системы Notch, остановку клеточного цикла, апоптоз и дифференцировку клеток медулобластомы. Такие клетки сохраняли способность к пролиферации, но не давали колоний в мягком агаре и опухолей при ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам, что позволяет полагать, что при этом воздействии были удалены опухолевые стволовые клетки.

Действительно, при блокаде сигнального пути Notch с помощью ингибиторов секретазы было обнаружено снижение доли CD133 клеток в 5 раз, и полностью исчезала фракция клеток, составляющая SP . Уровень апоптоза при блокаде Notch с помощью ингибиторов был почти в 10 раз выше в примитивных нестин-положительных клетках по сравнению с нестин-отрицательными. Таким образом, опухолевые стволовые клетки мозга высоко чувствительны к блокаде сигнального пути Notch.

Сигнальный путь Wnt.

Wnt – гликопротеины, действующие локально, связываясь со специфическим рецептором. Семейство белков-лигандов Wnt у млекопитающих насчитывает 19 членов. Если локальная концентрация белков Wnt превышает связывающую способность их ингибиторов, то Wnt взаимодействуют со своим рецептором, получившим название Frizzled, и ко-рецептором LRP 5/6 . Frizzled — трансмембранный белок, пронизывающий мембрану клетки 7 раз, ко-рецептор LRP 5/6 — трансмембранные белки с одним трансмембранным доменом. При взаимодействии Wnt с рецептором происходит образование сложного рецепторного комплекса, что в сою очередь приводит к активации канонического сигнал-передающего пути катенин/ТСF и нескольких иных путей, включая пути, опосредованные ?-концевой киназой Jun или ионами кальция .

Если лиганды Wnt отсутствуют, катенин связывается цитоплазматическими белками, которые его фосфорилируют и подготавливают тем самым к убиквитилированию и последующей деградации в протеасомах.

В результате связывания Wnt с рецептором происходит дестабилизация комплекса, разрушающегокатенин и, соответственно, стабилизация катеина. Он транслоцируется в ядро, где связывается с факторами транскрипции семейства ТСF/LEF (Т-клеточный фактор/лимфоидный усиливающий фактор), и активирует экспрессию других, более отдаленных мишеней сигнального пути Wnt, включая циклины, С-myc и костные морфогенетические белки (ВМР).

Мутации в белках дестабилизирующего комплекса также приводят к повышению уровня катенина и развитию рака .

Активация сигнального пути, индуцируемого Wnt, обнаружена при раках различной локализации.

Таким образом, важно отметить, что все рассмотренные сигнальные системы содержат большое число белков, участвующих в сложно регулируемых системах передачи сигналов в ядро клетки. Эти сигнальные пути участвуют в регуляции пролиферации и дифференцировки СК и в случае искажения их функций, могут приводить к индукции процессов канцерогенеза и/или ускорять рост опухолей.

Следует отметить, однако, что до последнего времени не было сведений о состоянии этих сигнальных путей в ОСК. Первым экспериментальным подтверждением представлений о том, что контроль процессов самообновления и дифференцировки опухолевых стволовых клеток регулируется такими сигнальными путями как Hh, Notch и Wnt явилась работа В.Y. Liu и соавторов . Авторами было показано, что гиперэкспрессия лиганда Wnt или конститутивная активность катенина в клетках молочной железы приводит к увеличению числа СК в молочной железе.

В специальных экспериментах с использованием культивирования клеток in vitro и в модели ксенотрансплантации опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы человека иммунодефицитным мышам удалось показать, что в регуляции процессов самообновления и нормальных СК и опухолевых стволовых клеток молочной железы важную роль играют компоненты сигнальной системы Hh – PTKH 1, Gli1 и Gli2. Активация системы Hh приводила к увеличению количества клеток, из которых образовывались сфероидные колонии СК молочной железы, названные маммосферами. Эти эффекты и размеры маммосфер были опосредованы Hh-зависимой индукцией экспрессии гена Bmi-1 и ингибировались циклопамином .

При исследовании опухолевых стволовых клеток молочной железы с фенотипом CD44+ CD24-/low Lin- авторы обнаружили в этих клетках повышение экспрессии таких компонентов системы Hh как РТСН 1, Gli1 и Gli2, а также гена Bmi-1 в 1,7, 30, 6 и 5 раз по сравнению с теми опухолевыми клетками, у которых отсутствовали маркеры ОСК. Полученные экспериментальные данные подтверждают представления о том, что дерегуляция процессов самообновления нормальной СК является одним из ключевых этапов, вовлеченных в ранние стадии канцерогенеза.

Сигнальная система Hh обеспечивает поддержание пула опухолевых стволовых клеток также при глиобластоме , множественной миеломе и лейкозе.

6. ОСК и опухолеспецифические антигены

Опухолеспецифические антигены (ОСА) – это белковые молекулы, присутствующие исключительно, или преимущественно, в опухолевых клетках. Если такие молекулы представлены на поверхности опухолевой клетки, то они имеют большое значение для диагностики опухолей и для разрушения опухолевых клеток по механизму антителозависимой клеточной цитотоксичности или путем комплементзависимого лизиса. Если ОСА являются внутриклеточными белками, то они могут распознаваться и элиминироваться антигенспецифическими цитотоксическими лимфоцитами (ЦТЛ). На сегодняшний день число известных Т-клеточных эпитопов, т.е. пептидных последовательностей ОСА, распознаваемых Т-лимфоцитами в контексте молекул МНС, превышает 200.

К ОСА, распознаваемым Т-лимфоцитами, относят широко распространенные опухолевые антигены, кодируемые такими генами, как MAGE, BAGE и GAGE. Это нормальные белки, которые экспрессируются клетками опухолей различных гистологических типов, но отсутствуют в клетках нормальных тканей взрослого организма, за исключением семенников. ОСА этого типа относят к классу антигенов рака и семенников (cancer-testis antigens, CTA ).

СТА составляют семейство генов, обладающих рядом общих свойств:

1. СТА экспрессируются в самых разных злокачественных опухолях, но экспрессия СТА в нормальных тканях отсутствует за исключением половых клеток: семенников, фетальных яичников, плаценты и трофобластов.

2. Экспрессия генов СТА регулируется эпигененетическими механизмами, в частности, с помощью метилирования ДНК.

3. СТА иммуногены.

Недавно было показано, что некоторые CTA вовлечены в дифференцировку СК . В настоящее время охарактеризовано около 40 различных СТА, но, несмотря на это, практически ничего не известно об их специфических функциях и связи с биологией СК.

Только недавно было обнаружено, что такие СТА, как N-RAGE, NY-ESO, MAGE-1 и SSX экспрессируются МСК костного мозга . Появились также указания о том, что СТА SSX участвует в процессе регуляции самообновления СК , в регуляции экспрессии металлопротеиназы -2 и миграции клеток .

Отсутствие экспрессии СТА в нормальных тканях (за исключением семенников) при высоком уровне экспрессии в опухолевых клетках привело к появлению концепции направленной терапии опухолей при использовании ОСА группы СТА в качестве молекулярных мишеней для создания противоопухолевых вакцин .

Данные последних лет, касающиеся экспрессии СТА и в СК, в частности в МСК, заставляют при создании методов направленной терапии принимать во внимание риск появления побочных эффектов, связанных с повреждением СК опухоленосителя, особенно МСК .

Новые представления о биологии опухолевых стволовых клеток позволяют переосмыслить известные данные о группе ОСА, получивших название онко-фетальных антигенов. Среди таких белков наиболее изученными являются раково-эмбриональный антиген (РЭА) , рецептор альфа-фетопротеина (РеАФП) , рецептор II типа белка Mullerian Inhibitory Substance (РеMIS) . Онкофетальный белок РЭА обычно экспрессируется на клетках аденокарцином толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы и желудка, в 50% случаев рака молочной железы и в 70% случаев немелкоклеточного рака легкого. РЭА интенсивно изучается и в качестве мишени для разработки различных способов иммунотерапии .

Экспрессия РеАФП обнаружена в опухолевых клетках самого разного происхождения, что позволило рассматривать этот белок в качестве универсального ОСА . Важно подчеркнуть, что его экспрессия не обнаруживается в нормальных клетках даже в зоне опухоли и отсутствует в доброкачественных опухолях, за исключением миксомы сердца — доброкачественной опухоли эмбрионального происхождения.

Если исходить из представлений о развития опухоли из опухолевых стволовых клеток по схеме ОСК > пролиферирующие прогениторные клетки > «дифференцированные» опухолевые клетки, можно придти к заключению, что онко-фетальный белок РеАФП обнаруживается, по-крайней мере, в прогениторных и более дифференцированных опухолевых клетках, а также в доброкачественных опухолевых клетках, имеющих эмбриональное происхождение.

Вопрос об экспрессии РеАФП и большей части других раково-эмбриональных антигенов в СК и опухолевых стволовых клетках пока не изучен. В то же время, РеMIS II обнаружен как в ОСК, так и в нестволовых опухолевых клетках человека и мыши при раке яичника .

Возможно, при выборе мишени для направленной терапии целесообразно ориентироваться не на ОСК, а на прогениторные клетки, чтобы избежать повреждения нормальных СК. Можно полагать, что при этом будет доступен подбор специальной схемы курсов лечения с помощью направленной и дифференцирующей терапии или терапии с использованием ингибиторов сигнальных путей СК для поддержания сохраняющихся в организме опухолевых клеток в «покоящемся» состоянии.

Важно подчеркнуть, что опухолеспецифические ЦТЛ, индуцируемые в процессе развития иммунного ответа в отношении ОСА, в том числе и ОСА из группы СТА, с равной эффективностью лизируют как обычные опухолевые клетки, так и клетки, характеризующиеся множественной лекарственной устойчивостью . Эта особенность ЦТЛ представляется крайне важной как для элиминации высоко резистентных к химиотерапии опухолевых клеток, возникающих как в результате индукции соответствующих генов в процессе лечения, так и опухолевых стволовых клеток и их ближайших потомков, для которых высокая резистентность является, как уже отмечалось, одной из характерных особенностей.

Таким образом, для использования ОСА, и особенно СТА, в качестве мишени при создании иммунологических и химиотерапевтических методов противоопухолевой направленной терапии необходимо учитывать все свойства ОСК и самым тщательным образом вести поиск антигенов, высоко специфичных в отношении опухолевых стволовых клеток по сравнению со СК, чтобы не повредить последние.

Одновременно с развитием представлений об ОСК новое звучание получили данные о роли ниши CК и опухолевых стволовых клетокК. Понимание функций клеток костного мозга в формировании ниши в различных зонах организма не только для СК, но и для ОСК позволяет понять значение микроокружения и его регуляторную роль в развитии опухолей и метастазов.

Стало очевидным, что для создания успешных методов направленной терапии рака необходим поиск ОСА, избирательно представленных не просто в опухолевых клетках, а именно в ОСК, причем такие ОСА должны отсутствовать в нормальных СК.

Важно также отметить, что создание клеточных технологий для целей регенеративной медицины основывается на использовании аутологических соматических СК. В тоже время, накопление мутаций в СК делает возможным возникновение ОСК из нормальных СК. Поэтому, хотя для МСК костного мозга человека в отличие от мышей не было обнаружено злокачественной трансформации СК, необходимо все манипуляции со СК проводить в условиях, максимально снижающих риск возникновения мутаций в этих клетках и исключающих неоправданную активацию сигнальных путей, приводящих к стимуляции пролиферации СК.

Это может быть достигнуто путем создания адекватных условий культивирования и максимального снижения времени культивирования СК in vitro. Кроме того, для заместительной терапии, по-видимому, целесообразно использовать предифференцированные СК, т.е. те культуры, в которых СК уже получили стимуляцию к дифференцировке в нужном направлении in vitro и содержат не только СК, но и большой пул прогениторных и начинающих дифференцироваться в нужном направлении клеток. Одновременно возможно формирование соответствующего клеточного микроокружения – ниши СК — в нужном месте для поддержки клеточных трансплантатов соответствующими цитокинами и снижения нежелательной миграции других клеток в зону трансплантации.