Отдельный ген или короткие сегменты ДНК не могут визуализироваться при микроскопическом исследовании, поэтому для идентификации мутаций применяются методы молекулярно-генетической диагностики. Информация, полученная в результате «Проекта генома человека», и другие достижения в области молекулярной генетики значительно расширили возможности пре- и постнатальной диагностики генетических заболеваний. Методы молекулярно-генетической диагностики обеспечивают раннее обнаружение и прогноз моно- и полигенных заболеваний с дебютом во взрослом возрасте. Технические возможности молекулярно-генетической диагностики могут выходить за этические рамки, установленные в отношении наследственных заболеваний, особенно если эти исследования должны проводиться в детском и подростковом возрасте.
Методы молекулярной цитогенетики
Количественные и структурные аномалии хромосом — распространенные причины многочисленных пороков развития и онкологических заболеваний. Идентификация этих хромосомных аберраций имеет важное значение при семейном консультировании для оценки прогноза и репродуктивного риска при будущих беременностях. Традиционный хромосомный анализ — «золотой стандарт» цитогенетической диагностики, однако он имеет ограниченные возможности. Методы молекулярно-генетической диагностики с применением флюоресцирующих меток, основанные на технологиях клонирования, и повышенная чувствительность конъюгатов антител способствуют выявлению тонких хромосомных изменений, не обнаруживаемых при классическом цитогенетическом исследовании. Такие техники расширяют диагностические возможности при обследовании детей с умственной отсталостью, пороками развития и многими другими заболеваниями.
Метод флюоресцентной гибридизации in situ
Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH — fluorescence in situ hybridization) включает применение уникальных нуклеотидных последовательностей ДНК в качестве зонда для поиска нужных последовательностей ДНК в материале, полученном от пациента. Локусспецифический или генспецифический ДНК-зонд помечен определенным маркером (например, флюорохромом), что обеспечивает его обнаружение при флюоресцентной микроскопии. Исследуемая ДНК представляет собой препарат хромосом для микроскопического исследования, содержащий нити в метафазе и ядра в интерфазе (в неделящемся состоянии). ДНК-зонд и исследуемую ДНК денатурируют, что приводит к образованию одноцепочных ДНК. ДНК-зонд добавляют к препарату хромосом и инкубируют в течение времени, достаточного для гибридизации ДНК-зонда и комплементарных последовательностей ДНК больного, если у больного имеется участок ДНК, комплементарный ДНК-зонду. Гибридизация происходит только на комплементарных участках ДНК и не касается фрагментов с иными последовательностями ДНК из других частей генома. Присутствие или отсутствие меченного флюорохромом зонда в составе ДНК после гибридизации определяется при исследовании хромосом с помощью флюоресцентной микроскопии. Результат данного метода молекулярно-генетической диагностики, как правило, не вызывает сомнения.
Преимущества метода молекулярно-генетической диагностики FISH включают быстрый анализ большого числа клеток, высокую чувствительность и специфичность, возможность исследовать некультивируемые и неделящиеся клетки. С помощью этого метода можно исследовать клетки, содержащиеся в парафиновых срезах. Недостатки метода заключаются в невозможности получить информацию о физическом состоянии исследуемой ДНК или участка хромосомы. Проведение FISH требует знания локуса, вовлеченного в хромосомную аберрацию, а также подбора соответствующего ДНК-зонда, который сможет выявить данную аберрацию. FISH не используется в качестве скринингового метода молекулярно-генетической диагностики. Метод применяется для того, чтобы получить ответ на конкретный вопрос (определить отсутствие или наличие предполагаемой специфической мутации). Как правило, он дополняет классические методы окрашивания хромосом, а также является основным способом идентификации хромосом в метафазе или интерфазе и специфических нуклеотидных последовательностей ДНК, лежащих в основе определенного заболевания (фенотип).
FISH применяют в пренатальной молекулярно-генетической диагностике и для характеристики опухолей; в педиатрической практике его используют, как правило, для идентификации субмикроскопических делеций, ассоциированных со специфическими пороками развития. Синдромы, в основе которых лежат микроделеции, раньше считались заболеваниями неизвестной этиологии, так как хромосомные делеции и перестройки, вызывающие развитие этих заболеваний, обычно не визуализируются при традиционных методах хромосомного анализа. Такие мелкие делеции в специфических участках хромосом можно с большой точностью выявить методом FISH. К заболеваниям, обусловленным субмикроскопическими делециями, относятся синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Вильямса, Миллера-Дикера, Смит-Мадженис и велокардиофациальный синдром. FISH облегчает диагностику этих синдромов в нетипичных случаях, особенно в младенческом возрасте, когда еще отсутствуют многие диагностически значимые признаки заболевания. Применение этого метода молекулярно-генетической диагностики целесообразно также в подростковом и во взрослом возрасте, когда типичные клинические признаки заболевания, характерные для детского возраста, претерпевают изменения.
Субтеломерические перестановки
В большинстве случаев транслокации вовлекают концы хромосом (теломеры). Большое количество генов, лежащих в основе наследственных синдромов, проявляющихся в виде пороков развития, локализовано в областях, прилегающих к теломерам, в субтеломерических областях хромосомы. Скрининг теломер с целью выявить хромосомных перестроек является ценным методом идентификации субмикроскопических хромосомных мутаций и перестроек, не обнаруживаемых при стандартном хромосомном анализе. FISH, применяемый для выявления субмикроскопических хромосомных перестроек у пациентов с умственной отсталостью, фокусируется на идентификации перестроек, расположенных на концах хромосом; субтеломерические аномалии обнаруживаются примерно у 7,5% этих пациентов.
Сравнительная геномная гибридизация
Сравнительная геномная гибридизация (СГГ) — это применение метода FISH для широкого скрининга генома с целью выявить различия в числе копий любых нуклеотидных последовательностей ДНК у пациента. СГГ была разработана для генетических исследований в сфере онкологии (первичные солидные опухоли), но в настоящее время применяется для определения локализации избыточного генетического материала или зон выпадения участков хромосом при предполагаемых хромосомных аномалиях. Этот метод молекулярно-генетической диагностики заключается в смешивании и одновременной гибридизации равных количеств меченной различными красителями тестируемой ДНК (например, меченной зеленым флюоресцирующим красителем) и нормальной референтной ДНК (например, красный флюоресцирующий краситель) с нормальными нитями в метафазе. В результате получают определенное соотношение зеленой и красной флюоресценции. При этом зоны амплификации тестируемой ДНК (многократного копирования) выявляются как зоны избыточной концентрации зеленого красителя, зоны выпадения — как красные участки, отражающие дефицит тестируемой ДНК, а при равном соотношении тестируемой и нормальной ДНК имеются области желтого цвета. Таким образом, СГГ позволяет получить карту нуклеотидных последовательностей ДНК в геноме. К преимуществам данного метода молекулярно-генетической диагностики относится возможность его применения к любой ткани. Метод не может выявить сбалансированные хромосомные аномалии, при которых количество копий ДНК не меняется. Разрешающая способность метода не позволяет идентифицировать хромосомные копии размером меньше 10 Мб, а также изменения числа копий, если выпадение участков хромосом или избыточный хромосомный материал содержатся менее чем в 50% анализируемых клеток.
Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH
Ограничение возможностей СГГ при выявлении сбалансированных хромосомных перестроек восполняется с помощью многоцветного окрашивания всех хромосом при однократной гибридизации. Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH (M-FISH) — взаимосвязанные методы молекулярно-генетического анализа, которые способны идентифицировать сбалансированные хромосомные перестройки. При обоих методах молекулярно-генетической диагностики каждая из хромосом в метафазе маркируется специфическим цветом, что позволяет одновременно визуализировать всю совокупность хромосом. 24 маркированных хромосомных зонда и 5 флюорохромов применяются в комбинации, что приводит к созданию комбинаторной схемы, в которой каждая из 22 аутосом, а также X- и Y-хромосомы окрашены в разные цвета. M-FISH требует применения специфических комплектов фильтров для каждого из 5 флюорохромов; при спектральном кариотипировании применяются спектроскопия и интерферометр для оценки паттернов флюоресцентной эмиссии. Эти методы позволяют выявить сложные хромосомные перестройки, мелкие транслокации и маркированные хромосомы. Недостатки методов включают невозможность идентифицировать мелкие интрахромосомные делеции или дупликации, а также перицентрические или парацентрические инверсии.
Методы ДНК-анализа
Молекулярные цитогенетические методы повышают диагностические возможности для выявления хромосомных делеций или дупликаций (содержащих десятки или сотни генов). Другие методы ДНК-анализа позволяют выявить изменения в отдельных генах. Проведение ДНК-анализа возможно в связи с тем, что ДНК — это относительно стабильная молекула, которая может быть изолирована из любых ядросодержащих клеток и сохранена для дальнейших исследований. Наиболее часто ДНК выделяют из лейкоцитов; другие ткани, применяющиеся для этого, включают амниотические клетки и ворсины хориона (при пренатальной диагностике), клетки, полученные из мазка со слизистой оболочки щеки, и фибробласты, полученные при биопсии кожи. При заборе этих тканей, как правило, удается выделить достаточное количество ДНК. Современные методы молекулярно-генетической диагностики, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют амплификацию ДНК, полученной всего из одной или нескольких клеток.
Саузерн, вестерн, нозерн-блоттинг
Саузерн-блоттинг — это первый метод молекулярно-генетической диагностики на молекулярном уровне. Сейчас он в значительной степени вытеснен методами, основанными на ПЦР, и прямым секвенированием ДНК. С помощью саузерн-блоттинга выделяют геномную ДНК пациента и разрезают ее на мелкие фрагменты с помощью рестриктаз (ферменты бактерий, которые расщепляют ДНК в строго специфических сайтах). Полученные фрагменты разделяют по размеру с использованием электрофореза в агарозном геле, переносят с помощью блоттинга на стабильный нейлоновый фильтр, фиксируют на фильтре, проводят гибридизацию с радиоактивно меченным ДНК-зондом, после чего проводят радиоавтографию. Данный метод молекуляно-генетической диагнстики позволяет выявлять мутации, если они изменяют длину фрагмента ДНК (сайт рестрикции), что изменяет результирующую картину ферментного расщепления. Саузерн-блоттинг по-прежнему наиболее часто применяется для выявления сцепления гена со специфическим врожденным полиморфизмом ДНК. Можно также проследить распространение гена у других членов семьи, даже если специфический молекулярный дефект, ассоциированный с наследственным заболеванием, не может быть идентифицирован.
При нозерн-блоттинге анализируются структура и количество мРНК, продуцированной специфическим геном. Расщепление РНК рестрикционными ферментами невозможно. Длина транскриптов различных РНК зависит от размера и количества экзонов в гене. Таким образом, мутации, которые изменяют количество или длину экзонов, можно определять в результате выявляемых изменений РНК при нозерн-блоттинге. Методика идентична саузерн-блоттингу, за тем исключением, что исследуется общая РНК клеток или очищенная мРНК, а не расщепленная рестриктазами ДНК.
Вестерн-блоттинг дает информацию о размере и количестве мутантных белков в клеточных экстрактах, полученных от пациентов со специфическими генетическими заболеваниями. Белки из клеточных экстрактов разделяют по размеру с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на мембрану. Затем мембрану инкубируют со специфическими антителами к белкам. Вторичные антитела (направленные против первых антител), меченные флюоресцирующим красителем Этот метод молекулярно-генетической диагностики применяется для определения наличия или отсутствия, а также размера мышечного белка дистрофина у пациентов с Х-сцепленной мышечной дистрофией.
Полимеразная цепная реакция
Хотя при некоторых заболеваниях большая часть мутаций возникает в результате крупных делеций ДНК, которые выявляются с помощью саузерн-блоттинга, большинство аномалий генов, лежащих в основе многих заболеваний, представляют собой точечные мутации. После обнаружения точечной мутации можно синтезировать конструкции ДНК (праймеры), покрывающие короткий участок, пораженный мутацией. Получение достаточного количества копий измененной ДНК может быть сложно, но ПЦР предоставляет множественные копии специфических фрагментов ДНК. При ПЦР амплификация ДНК осуществляется путем повторных тепловых циклов. ПЦР произвела революцию в диагностике мутаций. Это высокочувствительный, стандартизированный и автоматический метод молекулярно-генетической диагностики, который можно проводить на малом количестве образцов. Метод относительно недорог, в течение нескольких часов можно получить миллиарды копий специфических нуклеотидных последовательностей ДНК.
Прямое секвенирование ДНК
Автоматизированное секвенирование ДНК стало стандартным методом молекулярно-генетической диагностики во многих клинических лабораториях молекулярной генетики и способствовало значительному прогрессу «Проекта генома человека». Секвенирование ДНК особенно полезно в случаях небольших генов и в ситуациях, когда точная мутация у членов данной семьи неизвестна. Все выявленные изменения в структуре гена должны быть тщательно проанализированы, чтобы понять, лежат ли они в основе заболевания или относятся к нормальному полиморфизму.
Статью подготовил и отредактировал: врач-хирург Пигович И.Б.
Слышал существует возможность сдать анализы паре для проверки на риски заболевания их чада генетическими недугами перед планированием беременности. Где можно пройти такой тест и как определяются заболевания на которые стоит исследоваться?
В скором времени вообще можно будет недорого сделать полное генетическое картирование. Обещают, что в ближайшие годы стоимость снизится до $300! Там не надо будет выбирать, какие исследования определять а какие нет).
Вопрос к педиатрам. Как часто вы встречали ложно положительные результаты генетического скринингового теста новорожденных?
Такое бывает, но не часто. На моем опыте за 13 лет 8 раз.
Спасибо. Произошло в семье близких друзей. Ждем результатам генетического исследования.
Был в 2012 году, хотели что бы родители отказались от ребенка. Криминал.
Читала о том, что в Европе собираются разрабатывать метода генетического тестирования перед назначением препаратов, в первую очередь кардиологических. Честно говоря, пока не очень понятно, каким образом это будет происходить.
Кто-нибудь слышал о таком и как Вы это понимаете?
Фармакогенетика давно занимается проблемой подбора лекарств, еще в начале 50-х годов изучали гипертоксические эффекты от приема терапевтических доз изониазида ( фермент N-ацетилтрасфераза регулирует ацетилирование и выведение этого препарата, при мутации в гене скорость выведения зачительно падает). Установлены гены и описаны мутации отвечающие за метаболизм антикоагулянтов, миорелаксантов, сульфаниламидов и др.
С Варфарином, мало того что реально, так еще и необходимо.
Молекулярная диагностика это наша будивший в конце 21-веке все люди будут долго жителями.
Что?