Апелин представляет собой пептидный лиганд для орфанных G-белковых рецепторов (APJ-рецепторов) и выступает в качестве критического агента для миграции клеток мезодермального происхождения, которым суждено внести вклад в предрасположенность к инфаркту.
Настоящее исследование было разработано для создания надежного протокола клеточной дифференциации, в частности, для оценки влияния апелин-направленной дифференцировки мышиных и человеческих эмбриональных стволовых клеток (мЭСК и чЭСК) в клетки кардиальной линии.
Различные концентрации апелина в 50, 100, 500 нМ были протестированы для определения потенциала дифференцировки. Далее для изучения синергетических эффектов при лечении сердечной недостаточности, оптимальную дозу апелина в конкретной временной последовательности использовали в сочетании с мезодермальными факторами дифференцировки, в том числе БМП-4-активином и bFGF.
Изучены клеточные, молекулярные и физиологические характеристики апелин-индуцированных сократительных эмбриоидных тел (ЭТ), которые содержат производные всех трех эмбриональных зародышевых слоев, а их формирование является предпосылкой для образования большинства типов зрелых соматических клеток.
Было установлено, что 100 нМ апелина приводит к образованию наибольшего количества сократительных ЭТ для мЭСК, а максимальный эффект мЭСК отмечен при 500 нМ. Полученные мЭСК-ЭТ (Mebs) адекватно ответили увеличением сократимости на увеличение концентрации изопреналина и дилтиазема. В группах с апелином был подтвержден положительный фенотип сердечных маркеров. В протоколе с апелином и мезодермальными факторами повысилась сократимость в значительно большем проценте полученных чЭСК-ЭТ (hEBs). В итоге показано, что лечение апелином усиливает дифференцировку стволовых клеток мышей и человека в клетки сердца. Также был выявлен синергетический эффект апелина и мезодермального фактора дифференцировки.
Мышиные ЭСК линии TL1 были получены из 129Sv/J мышей и преумножены на слое облученных мышиных эмбриональных фибробластов, CF-1 линии (MEF) в среде Дульбекко с высоким содержанием глюкозы с 15% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS), 1% незаменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,05 мМ ?-меркаптоэтанола (?-ME) и 1000 ед/мл фактора подавления лейкоза (LIF).
ЭСК человеческой линии H7 преумножались на слое облученного MEF CF-1 линии на 0,2% покрытии желатином. ЭСК человека культивировали в DMEM с 20% сывороткой KnockOut Replacer (Gibco), 1% незаменимых аминокислот, 1% пенициллина/стрептомицина, 0,05 мМ ?-ME, 2 мМ L-глютамина (Gibco) и 4 нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF). Для исследования были использованы клетки, полученные из проб 20-60. Культуры были выращены при 37°С и 5% CO2 в увлажненной нормобарической среде.
В исследовании стремились определить синергетический эффект апелина на повышение эффективности сердечной дифференцировки в двух протоколах с использованием мезодермальных факторов дифференцировки. Апелин, БМП-4, активин-bFGF существенно повысили эффективность сердечной дифференцировки. Более высокий процент сократительных ЭТ до регуляции раннего и зрелого сердечных маркеров, а также увеличение доли CTnT + клеток подтвердил синергетический эффект апелина в развитии сердечной недостаточности. Наличие апелина, судя по всему, способствовало набору и агрегации совершенных мезодермальных клеток-предшественников.
Несмотря на то, что не было найдено индуцированной сократительной активности, в ранее опубликованном исследовании обнаружили еще один механизм с влиянием легкой цепи миозина на экспрессию генов L под действием апелина. В докладе указывается, что апелин/APJ сигнализация была возможна через митоген-активированную протеинкиназу/p70S6. В других исследованиях было показано, что в изолированных миоцитах желудочка взрослой крысы апелин не модулирует L-каналы Ca2+ или энергозависимые K+ каналы, и не изменяет уровень внутриклеточного кальция. Эти данные согласуются с результатами настоящего исследования в отношении Ca2+, когда воздействие апелина на ЭСК существенно увеличило максимальную сократительную силу, в то время как обмен Ca2 + остался прежним.
Другие исследования показали, что в сердечной мышце преобладающей изоформой был апелин-13 — самый мощный эндогенный агент инотропного испытания. При использовании апелина в зрелых кардиомиоцитах было зафиксировано увеличение сократимости саркомера в 1,4 раза, в результате чего повышалась сократимость всего сердца крысы. Эти результаты подтверждают вывод, что апелин не только усиливает дифференцировку и созревание ЭСК в клетки сердца, но и повышает их сократительную функцию.
Хотя механизм действия инотропного апелина остается неясным, было установлено, что этот механизм независим от ангиотензина II, эндотелина-1, катехоламинов и окиси азота. Исследования показали, что это может быть связано с повышением доступности активатора Ca2+ и/или увеличением чувствительности к Са2+. Хотя имеются сообщения, что при добавлении апелина незначительное увеличение кальция в зрелых кардиомиоцитах не изменяет чувствительность к Ca2+. Наконец, сообщалось, что эффект апелина на сократимость миоцитов крыс модулируется через протоновую помпу сарколеммы, что приводит к сенсибилизации миофиламентов к Са2+. Эти сведения согласуются с полученными данными о том, что у апелин-индуцированных и неиндуцированных групп не изменяется обмен Са2+.
В заключение, данное исследование показало, что апелин усиливает сердечную дифференциацию в сочетании с мезодермальным фактором дифференциации, БМП-4-активиом и bFGF. Основной механизм, возможно, заключается в повышении агрегации мезодермальных клеток-предшественников. Будущие исследования позволят создать эффективную стратегию сортировки клеток для отбора сердечных клеток-предшественников.
Статью подготовил и отредактировал: врач-хирург Пигович И.Б.