Антибиотик группы аминогликозидов гентамицин широко используется при лечении инфекций, обусловленных грамотрицательными микроорганизмами. Тем не менее, его клиническое применение ограничено у каждого пятого пациента способностью индуцировать острое повреждение почек, вследствие стимуляции апоптоза в мезангиальных клетках и проксимальных канальцах. Как известно, в этом процессе важное значение играют митохондриальные пути, а медиаторами выступают активные формы кислорода (АФК).
Важный регуляторный фактор защиты от гипоксии гипокси-индуцируемый фактор (HIF) — фактор транскрипции состоит из чувствительных к кислороду субъединиц ? и ?. В условиях нормоксии субъединицы ? под действием пролол-гидроксилазы быстро проходят кислород-зависимое гидроксилирование пролинового остатка (ПГЛ). При гипоксии субъединицы ? не подвергаются пролил-гидроксилированию и связываются с субъединицами ?, что позволяет HIF транслоцироваться в ядро и активировать транскрипцию генов, участвующих в таких процессах как эритропоэз, ангиогенез, клеточный метаболизм, клеточная пролиферация и апоптоз. Ингибиторы ПГЛ стабилизируют и активируют HIF, тем самым повышая эффекты этого фактора. На сегодняшний день из ингибиторов ПГЛ известны диметилоксалилглицин (DMOG) и кобальт.
Считается, что ап-регуляция HIF играет важную протекторную роль в различных моделях заболеваний почек, в том числе при ишемическом или нефротоксическом остром повреждении, а также при хронической болезни почек. Недавно было продемонстрировано антиоксидантное действие HIF при почечной ишемии-реперфузии и диабетической нефропатии. Кроме того, активация HIF приводит к подавлению апоптоза клеток почечных канальцев при цисплатин-индуцированной нефротоксичности.
Целью данного исследования была оценка протекторных свойств HIF при гентамицин-индуцированном поражении клеток почечных канальцев in vitro и in vivo.
Материалы и методы. Данное исследование проводилось на культуре клеток эпителия проксимальных канальцев почек человека и на животных моделях.
В первом опыте клетки были разделены на четыре группы: 1) контрольные клетки; 2) обработанные гентамицином клетки; 3) предварительно обработанные кобальтом и гентамицином клетки; 4) предварительно обработанные DMOG и гентамицином клетки. Предыдущие исследования показали, что не наблюдалось никаких неблагоприятных эффектов при обработке клеток кобальтом или DMOG в дозах, используемых в настоящем исследовании. Гентамицин-опосредованный апоптоз в клетках обнаруживался при помощи ферментативной маркировки разрывов ДНК TUNEL окрашиванием.
Второй опыт проводился на животной модели. Семнадцать самцов крыс Sprague-Dawley рандомизированы на три группы: контроль, гентамицин + физиологический раствор 0,9% (GM+VEH) и гентамицин + кобальт (GM+Co). Ранее подтверждено, что применяемая доза кобальта не оказывает неблагоприятного воздействия на организм крысы.
Для стимулирования острого поражения почечной ткани в группах GM+VEH и GM+Co вводилось внутримышечно 80мг/кг гентамицина однократно ежедневно в течение 7 суток. Контрольной группе вводился 0,9% физиологический раствор.
После 7 дней эксперимента были собраны образцы крови для оценки уровня креатинина и мочевины, и для морфологического и иммуногистохимического анализов под наркозом кетамином и ксилазином были изъяты почки. Помимо этого в течение последних суток собиралась моча для оценки объёма, концентрации белка, уровня мочевины и креатинина.
Результаты и выводы. Кобальт и DMOG являются ингибиторами ПГЛ и поэтому способны активировать HIF.
В опыте in vitro уровень HIF-1? существенно не различался в контроле и обработанных гентамицином клетках. При этом концентрация HIF-1? была значительно выше в клетках, предварительно обработанных кобальтом или DMOG. При TUNEL окрашивании выявлено, что число подвергшихся апоптозу клеток после обработки гентамицином заметно увеличились. Предварительная обработка кобальтом или DMOG значительно сократила гентамицин-индуцированный апоптоз.
В опыте in vivo ап-регуляция HIF-1? введением кобальта была продемонстрирована методом вестерн-блоттинга гомогената клеточных ядер почек. Также как и в опыте с культурой клеток, уровень HIF-1? существенно не различался в группе контроля и GM+VEH. При этом концентрация HIF-1? была значительно выше у крыс группы GM+Co. В группе GM+Co был значительно увеличен уровень мРНК эндотелиального фактора роста сосудов — VEGF (3,16 ± 2,49 раза по сравнению с контролем), что говорит о проявлении эффекта HIF.
Для анализа гентамицин-индуцированного апоптоза в почках крыс был использован метод TUNEL окрашивания, выявляющий разрывы нитей ДНК. Подвергшиеся апоптозу клетки были обнаружены в группах GM+VEH и GM+Co, однако у получавших кобальт крыс количество этих клеток было в три раза меньше, что говорит о высокой эффективности препарата.
Нефропротекторные свойства кобальта подтверждались и такими лабораторными показателями как уменьшение протеинурии и увеличение клиренса креатинина.
Данное исследование доказывает высокую эффективность ингибиторов пролол-гидроксилазы в качестве нефропротекторов при гентамицин-опосредованном поражении почек, однако, необходимо проведение клинических исследований.