медицинский портал

Разделы медицины

  • Информация
    • Акушерство и гинекология
    • Детская хирургия
    • Гастроэнтерология
    • Колопроктология
    • Нейрохирургия
    • Онкология
    • Отоларингология
    • Пластическая хирургия
    • Сосудистая хирургия
    • Травматология и ортопедия
    • Урология
    • Флебология
    • Хирургия
    • Эндокринология
    • Препараты
    • Пациентам
▼ Я покупаю ссылки здесь ▼

Технология культивирования клеток

Пост опубликован: 07.12.2020

Определяющий параметр технологии культивирования клеток — прирост количества клеток. При использовании посадочной концентрации клеток 200 тыс./мл увеличение количества клеток вдвое происходило за первые 8 сут. Максимальный прирост клеточной массы (в 2,5 раза) наблюдался к 12-м суткам культивирования. После этого увеличение числа клеток замедлялось. При посадочной концентрации клеток 150 тыс./мл увеличение количества клеток вдвое происходило к 9-м суткам. Троекратный прирост клеточной массы наблюдался к 18-м суткам культивирования. Таким образом, при меньшей посадочной концентрации клеток можно получить значительный прирост клеточной массы, но при этом сроки культивирования увеличиваются.

Исследование фибробластов в трансмиссионном микроскопе показало, что уже к 3 ч культивирования фибробласты активно перемещаются вглубь геля.

В начальный период было отмечено, что фибробласты имеют довольно осмиофильную кариоплазму со значительной концентрацией хроматина под кариолеммой. Ядерные поры широкие, закрыты одноконтурной осмиофильной мембраной. В цитоплазме фибробластов большое количество α-цитомембран шероховатой эндоплазматической сети с интенсивно осмиофильными рибосомами. В цистернах шероховатой эндоплазматической сети содержится филаментозный материал, свидетельствующий об активном биосинтетическом состоянии фибробластов с накоплением преколлагена и гликозамингликанов. В околоядерном пространстве фибробластов наблюдалось большое количество митохондрий с развитыми криптами и осмиофильно средним матриксом.

В некоторых случаях наблюдались центриоли клеточного центра. По мере увеличения сроков жизни неодермы фибробласты значительно удлинялись, приобретали веретенообразную форму. Цитоплазма фибробластов чётко делилась на ядросодержащую и цитоплазматическую часть, а цитоскелет претерпевал изменения в виде скопления осмиофильных волокон проколлагена под цитолеммой с образованием так называемых контрактильных колец.

В трёхмерном коллагеновом геле наблюдалось значительное количество коллагеновых волокон, располагающихся в начале эксперимента (3-12 ч) хаотично и образующих упорядоченные регуляторные пучки волокон на вторые сутки культивирования клеток.

Таким образом, фибробласты в коллагеновом геле вырабатывают компоненты ВКМ, упорядочивая структуру коллагенового геля подобно межклеточному матриксу дермы.

Поскольку контракция геля фибробластами моделирует поведение раны, было проведено изучение влияния фибробластов на контракцию трёхмерного коллагенового геля. Многие факторы, оказывающие влияние на фибробласты, действуют на степень контракции геля. Наибольший интерес вызывает взаимодействие фибробластов с кератиноцитами.

Для этой цели фибробласты высевали в чашки Петри диаметром 35 мм в концентрации 200 тыс./мл геля. Концентрация коллагена составила 1,5 мг/мл. При низкой концентрации коллагена (0,5 мг/мл) обычно происходит очень резкая его контракция, но гель образуется рыхлым и непрочным, а при высокой концентрации коллагена (5 мг /мл) контракция геля слабо выражена. Через 2 ч после образования геля на его поверхность высевали эпидермальные кератиноциты, выделенные из кожного лоскута в количестве 200 тыс./мл среды.

В результате эксперимента было выявлено, что при совместном культивировании фибробластов и эпидермальных кератиноцитов наблюдалось хорошо выраженное усиление контракции. Фибробласты контрактировали гель весьма активно, что является нормой, а при культивировании фибробластов и эпидермальных кератиноцитов контракция геля резко усиливалась.

Результаты исследований других авторов по контракции коллагенового геля под влиянием фибробластов показали, что кератиноциты выделяют факторы, стимулирующие фибробласты. В свою очередь мезенхимные клетки оказывают влияние на поведение кератиноцитов, выражающееся в усилении их пролиферации.

Эти результаты позволяют утверждать, что мезенхимные клетки и эпидермоциты влияют на контракцию геля двумя способами:

  • во-первых, путем непосредственного контакта с коллагеновым матриксом;
  • во-вторых, потенцируют действие других клеток, которые вызывают контракцию геля. Это осуществляется дистантно, по-видимому, за счёт выделения факторов роста или компонентов ВКМ.

Как было указано выше, дермальный эквивалент представляет собой трёхмерный коллагеновый гель, в котором находятся фибробласты кожи. До настоящего времени применение дермального эквивалента в связи с проблемой его быстрого устаревания было достаточно ограниченным. Фибробласты, помещённые в трёхмерный коллагеновый гель, вызывают его контракцию и теряют способность к пролиферации, что предопределяет создание данной структуры непосредственно перед трансплантацией. Использование микроносителей с прикреплёнными к ним фибробластами снимает эту проблему, так как фибробластам необходимо время для того, чтобы мигрировать с поверхности микроносителей.

То, что клетки кожи мигрируют с микроносителей на коллагеновый гель, даёт основание полагать, что они также могут мигрировать с микроносителей на раневую поверхность.

Таким образом, данная конструкция — трёхмерный коллагеновый гель с клетками кожи человека на микроносителях — может с успехом использоваться в качестве трансплантата.

При работе с данной конструкцией достигается ряд преимуществ:

  • конструкция обеспечивает хранение, транспортировку и трансплантацию клеток без каких-либо промежуточных подготовительных манипуляций;
  • при создании конструкции микроносители с клетками равномерно распределяются внутри геля, что после трансплантации обеспечивает равномерное распределение клеток на раневой поверхности;
  • коллагеновый гель, включающий в себя микроносители с клетками, после трансплантации на раневую поверхность, способствует сохранению клеток, предотвращает высыхание, обеспечивает питание, что особенно важно в первые часы после пересадки.

Таким образом, созданный модифицированный дермальный эквивалент значительно упростил процедуру трансплантации.

Хранение выращенных клеточных трансплантатов является важной составляющей всей технологии культивирования и использования клеток для восстановления кожных покровов. Возможность хранения открывает перспективы создания запасов (банков) подготовленных трансплантатов. Известен способ хранения выращенных эпидермальных пластов при температуре +24…26 °С в течение 10-12 сут.

Попытка кратковременного хранения выращенных на микроносителях фибробластов человека в стационарных условиях при температуре +24…26 °С не привела к удовлетворительным результатам. Уже через 3-4 сут клетки отделялись от поверхности микроносителей. Часть их мигрировала на поверхность культурального сосуда.

Через 5-6 сут в среде было множество погибших клеток, открепившихся от микроносителей, а к 10-м суткам происходили регрессивные изменения, не позволяющие трансплантировать выращенные клетки.

 

Именно поэтому метод, пригодный для кратковременного хранения эпидермальных пластов, оказался непригоден для фибробластов, выращенных на микроносителях.

Для кратковременного хранения выращенных на микроносителях клеток мы использовали трёхмерный коллагеновый гель, поскольку он является аналогом дермы (рис. 6.4).

Фибробласты, выращенные на микроносителях, будучи заключёнными в трёхмерный коллагеновый гель, сохраняли жизнеспособность до 1 мес. Это происходило как при +24…26 °С, так и при температуре +37,5 °С.

Созданная конструкция не требовала никаких обработок в процессе хранения (рис. 6.5).

Для длительного хранения клеток кожи человека на микроносителях использовали криоконсервацию, а именно хранили культуру в жидком азоте при температуре -193 °С.

  • для кратковременного хранения при комнатной температуре, не требуя дополнительных способов консервации;
  • для долговременного хранения в жидком азоте.

Это позволяет создать запас клеток, а значит развернуть банк клеточных трансплантатов.


Статью подготовил и отредактировал: врач-хирург Пигович И.Б.

Видео:

Полезно:

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Купить другую книгу из каталога

Медицинский сайт Surgeryzone

© 2010  
Информация не является указанием для лечения. По всем вопросам обязательна консультация врача.




Adblock detector