Исследование биоптата

Гистопатологическое исследование биоптата носит субъектив­ный характер и представляет собой область, относя­щуюся равно к науке и к искусству.

Существует множе­ство указаний в печатных работах, свидетельствующих о том, что биоптаты представляют наиболь­шую сложность для гистопатологоанатома, в особенно­сти образцы, взятые при эндоскопии, если ткань, кажу­щаяся патологической при эндоскопии, при гистологи­ческом исследовании оказывается нормальной, и нао­борот. В нескольких исследованиях было показано, что при исследовании биоптата, взятого во время эндоскопии, интерпретации изменений, предло­женные разными патоморфологами, редко совпадают. Более того, отсутствуют четкие гистопатологические критерии для постановки окончательного диагноза, иногда также отличаются критерии и терминология, которыми пользуются в Северной Америке и Европе. Было предпринято всего несколько попыток привести критерии гистопатологической диагностики заболева­ний ЖКТ, печени и поджелудочной железы к единому стандарту.

Заключение патоморфолога после исследования биоптата должно содержать подробное описание предоставленного образца (осо­бенно это касается биоптатов, полученных при лапа­ротомии, или биоптатов, полученных при аутопсии), что дает хирургу дополнительную уве­ренность в том, что биоптат, отправленный в лаборато­рию, является тем же самым образцом, который брал сам врач для исследования. Наряду с комментариями, носящими поясняющий характер, и диагностическим заключением, следует составить отчет по результатам микроскопического исследования биоптатов из каж­дой области. В случае образцов, полученных во время эндоскопии или методом толстоигольной биопсии, патоморфолог может попытаться сделать общий об­зор множественных образцов, но должен выделить каждую локализованную патологию (например, «об­щий вид образцов соответствует норме, но в одном об­разце слизистой из области дна желудка имеется очаг изъязвления и инфильтрации нейтрофилами»). При исследовании биоптатов, полученных при эндоско­пии с помощью биопсийных щипцов, патоморфолог может столкнуться со следующими сложностями (их можно отметить в заключении):

• правильное размещение биоптата для приго­товления среза обеспечить сложно, поэтому представлен поперечный срез ворсинки вме­сто продольного сечения единицы ворсинка-крипта;
• фрагментация материала биопсии с отделени­ем эпителиального слоя;
• артефакт, связанный с раздавливанием матери­ала биопсии, в результате чего произошло раз­рушение тонких клеточных структур.

Кроме того, частыми артефактами образцов, полу­ченных при эндоскопии, являются небольшие очаги поверхностного или периферического кровотечения, связанные с отделением соединительной ткани от собственной пластинки, которые следует отличать от отека. В последних исследованиях описана различная степень качества биоптатов, полу­ченных во время эндоскопии, проведенной в разных диагностических гистопатологических лаборатори­ях, и установлена более тесная связь этих различий с качеством образцов, предоставляемых врачом, а не с техническим процессом приготовления среза.

Была проведена работа с целью дифференциации воспалительных поражений по тяжести воспаления и природе воспалительного инфильтрата. Единой схемы классификации нет, но большинство патоморфологов используют 4-балльную шкалу: норма (0), слабо вы­раженное (2), умеренно выраженное (3), значитель­но выраженное (4), воспаление. Характер воспаления может описываться как нейтрофильный, гранулематозный (доминируют макрофаги), пиогранулематозный (нейтрофилы и макрофаги), эозино­фильный, лимфоплазмацитарный (доминируют лим­фоциты и плазматические клетки) или смешанный. Более того, описываются нарушения микроархитек­туры слизистой оболочки (например, укорочение ворсинок, дилатация млечных протоков, изъязвление, искривление крипты, абсцесс крипты).

Также не существует единой схемы классификации новообразований при исследовании биоптата. Необ­ходимо описать характер клеточной популяции ново­образований (например, эпителиальные, веретено­образные клетки, округлые клетки), гистологического расположения (например, пластинчатое, гроздевид­ное, завитое) и цитологические признаки (например, плеоморфизм, ядерно-цитоплазматическое соотноше­ние, ядрышки, хроматин, митоз). Также должны быть описаны и другие основные параметры, такие как вы­раженность деструктивных изменений ткани, инфиль­трация глубоких слоев (трудно оценить, если материал был взят биопсийными щипцами при эндоскопии) или инвазия кровеносных или лимфатических сосудов.

Эти же основные принципы интерпретации при­менимы для исследования биоптатов печени или поджелу­дочной железы при воспалительных заболеваниях или новообразованиях, а также при сообщении о вы­явленных нарушениях. По возможности производит­ся оценка всего предоставленного образца печени, а в случае исследования биоптатов поджелудочной желе­зы — оценка и эндокринной, и экзокринной ткани.

Специальные патоморфологиче­ские исследования биоптатов

Специальные красители для окрашивания биоптатов

Исследование срезов, окрашенных гематоксилином и эозином (ГЭ-окрашивание), — начало гистопатологического исследования. В большинстве случаев после этого не требуется дополнительная оценка, но во многих гистопатологических лабораториях при­меняется набор специальных красителей для оценки специфических свойств биоптатов. Они выбирают­ся патоморфологом на основе оценки окрашенного гематоксилин-эозином среза, однако врачу они могут сообщить полезную информацию (например, «воз­можно присутствие микобактерий; рекомендуется окраска по Цилю-Нильсену»),

В случае гранулематозных или пиогранулематозных воспалительных изменений, в обычной практи­ке исследования биоптатов используется набор специальных красителей, со­держащий краситель Грама (для бактерий), йодную кислоту — реактив Шиффа (PAS, для грибов), кра­ситель Циля-Нильсена (ZN, для кислотоустойчивых бактерий), чтобы установить этиологию инфекции. Окрашивание серебром по Вартин-Старри может ис­пользоваться для выявления спирохет. Врач дол­жен знать, что окрашивание такими красителями яв­ляется сравнительно малочувствительным методом, и результат может оказаться отрицательным, в то время как посев на питательные среды для культивирова­ния возбудителя или полимеразная цепная реакция (ПЦР), как правило, дает положительный результат. Однако специальные красители, как правило, могут применяться ретроспективно (то есть для образцов, предоставленных для обычного гистопатологического исследования), в то время как для культивирова­ния и ПЦР требуется свежий образец ткани. Краси­тель Гимза может использоваться для идентификации простейших (например, лейшманий). Когда эозинофилы трудно увидеть в некоторых ГЭ-окрашенных срезах, специальные красители, такие как Сириус красный, могут выделить эти клетки и провести оцен­ку их значения при воспалительной энтеропатии. При новообразованиях наиболее известным примером специального окрашивания является использование толуидинового синего красителя для диагностики мастоцитомы.

Использование специальных красителей чаще ре­комендуется для оценки биоптатов печени. Чаще все­го внутри гепатоцитов выявляют гранулярный пиг­мент, после чего необходимо различить, присутствует ли железо (гемосидерин, окраска берлинской лазурью по Перлу) или медь (окраска рубеановодородной кис­лотой). Накопление меди встречается чаще, чем в настоящее время ее выявля­ют, поскольку краситель рубеановодородная кисло­та не всегда есть в наличии. Краситель Фуше может использоваться для выявления желчного пигмента в случае обструкции желчных протоков. Фиброз пе­чени можно увидеть при окраске гематоксилином по Ван-Гизону (HVG), которая позволяет выявить коллаген, и при окрашивании серебром, например по методу Гордона и Свита, при котором окрашива­ются ретикулярные волокна. Липиды печени могут быть окрашены по Ойлу красным О, а гликоген — с помощью реактива Шиффа (PAS), но эти красители применяются для замороженных срезов ткани. На­копление амилоида может быть выявлено при окра­шивании Конго красным для оценки среза в поляри­зованном свете с двойным лучепреломлением. Тот же набор специальных красителей для выявления пато­генных микроорганизмов может быть применен при исследовании биоптата тканей печени в случаях, когда предпо­лагают воспалительное поражение печени, возможно, вызванное бактериями.

Электронная микроскопия биоптатов

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) редко требуется для исследования биоптата или не всегда может быть выполнена в повседневной диагностике заболеваний. Однако в некоторых случаях ТЭМ полезна для оценки микро­организмов, которые трудно идентифицировать при световой микроскопии (например, энтероиатогенную Escherichia coli или Cryptosporidium), либо для выявле­ния ультраструктурных повреждений (например, па­тологическое накопление лизосом). Для ТЭМ можно использовать заранее приготовленные образцы, взяв их из парафинового блока. Для предстоящего ТЭМ исследования биоптатов оптимальным является фиксация тка­ни в глутаральдегиде, а сотрудникам лаборатории не­обходимо сообщить о специальных требованиях при подготовке данного образца ткани.

Иммуногистохимическое исследование биоптата

При иммуногистохимии используются антитела (по­ликлональные или моноклональные) для выявления специфических антигенных молекул в образце ткани. Некоторые антитела можно использовать для ткани, фиксированной формалином, что делает возможным ретроспективное исследование тех же биоптатов, что применялись при обычном гистопатологическом ис­следовании. Другие антитела можно применять только для свежей ткани, подвергнутой быстрому заморажи­ванию, эти срезы получают в криостате. Существует специальный порядок мгновенного замораживания образцов ткани для иммуногистохимического исследо­вания, и обычно ее применение невозможно в услови­ях общей практики. Если опыт использования метода иммуногистохимии для исследования биоптатов отсутствует в обычной практике, имеет смысл проконсультироваться с лабораториями относительно их требований при взятии образцов.

Принцип иммуногистохимии — связывание антител с молекулами-мишенями определяется по маркировке первичного или вторич­ного антитела либо флуорохромом (иммунофлюоресценция), либо ферментом (иммунопероксидаза). В данной методике для усиления реакции могут приме­няться различные дополнительные вещества (напри­мер, иммуногистохимическое исследование с приме­нением авидин-биотина). Иммуногистохимия стано­вится все более доступной, так как все большее число лабораторий могут позволить приобретение оборудо­вания для проведения автоматической иммуномар­кировки. Иммуногистохимия, проводимая вручную, представляет собой трудоемкий и дорогостоящий процесс исследования биоптатов, не получивший большого распространения.

Иммуногистохимия может использоваться для выявления специфических возбудителей в тканях и является более чувствительным методом, чем специ­альное окрашивание тканей, описанное выше.

Перспективы развития методов диагностики

Будущее исследования биоптатов тканей не ограни­чивается перспективой развития световой микро­скопии. Экспериментальные исследования показали возможность идентификации ДНК или РНК ми­кробной клетки в свежей или фиксированной ткани с помощью Г1ЦР или реверсивно-транскрипционной ПЦР (РТ-ПЦР) амплификации и количественного определения уровней экспрессии в этих материалах с помощью РТ-ПЦР в реальном масштабе времени. Эти методики исследования ткани пока трудно создать и контролировать, однако уже сегодня можно приобре­сти ПЦР-наборы для выявления генетического мате­риала микроорганизмов в пробах крови.

РТ-ПЦР и РТ-ПЦР в реальном масштабе времени также применимы к биопсийным образцам ткани для выявления (и количественного определения) транс­крипции гена цитокина; возможно, специфический «цитокиновый профиль» соответствует определенно­му заболеванию (например, подтипы ВЗК). Ряд дру­гих основных иммунологических молекул может быть косвенно установлен с помощью РТ-ПЦР, но главное ограничение данной методики исследования биоптатов заключается в том, что продукция информационной РНК необязательно эк­вивалентна синтезу закодированного белка.

Последние исследования биоптатов по­казали, что можно оценить клональность лимфоидной популяции и отличить лимфому от воспа­ления на основе ограниченного генотипа. В США уже можно приобрести набор для анализа клональности по цитологическим образцам, скоро в продаже также появится набор для исследования биоптатов ткани. В идеале биопсийные образцы по-прежнему будут про­ходить привычную гистопатологическую оценку, но диапазон методик дальнейшего анализа биоптатов в будущем будет существенно расширен.