Как было отмечено выше, одна из трудностей, возникающих при разработке метода лечения обширных дефектов кожи, состоит в необходимости наращивания большой клеточной массы. Выращивание клеточных культур на плоской подложке не позволяет решить эту задачу в полном объёме.
Поэтому перспективным направлением оказалось выращивание клеток на микроносителях, представляющих собой мелкие частицы, к которым прикрепляются клетки и которые могут находиться в питательной среде во взвешенном состоянии. В этом случае существует реальная возможность культивирования клеток в промышленном масштабе.
Культивирование клеток на микроносителях было впервые предложено Ван Везелом, использовавшим для этого гранулы декстрана (сефадекс А-50). Проведённая с тех пор большая исследовательская работа привела к тому, что в настоящее время имеется много различных типов микроносителей.
Применение микроносителей сочетает преимущества монослойного и суспензионного методов культивирования и имеет следующие достоинства:
- возможность одновременного культивирования десятков и сотен миллиардов клеток;
- обеспечение равномерных условий для роста клеток по всему объёму культиватора, что позволяет эффективно контролировать и регулировать такие параметры, как pH среды, pO2 и другие;
- получение высокой плотности клеточной популяции (до нескольких миллионов клеток в 1 мл);
- экономия питательной среды;
- возможность визуального контроля состояния клеток;
- осуществление прямого подсчёта числа клеток с помощью набора проб;
- возможность хранения выросших на микроносителях клеток при низких температурах;
- уменьшение риска контаминации культур.
Обобщая имеющиеся данные, Ван Везел сформулировал требования к микроносителям. По его мнению, микроносители должны иметь следующие основные характеристики:
- форма сферическая или волокнистая;
- положительный заряд поверхности в пределах 1,5-1,8 мЭкв/г, в связи с тем, что мембраны большинства клеток имеют слабоотрицательный заряд, благодаря чему они будут легче адгезировать к такому микроносителю;
- плотность 1,03-1,15 г/см3 является оптимальной для поддержания микроносителей в суспензии;
- диаметр частиц от 100 до 250 мкм может обеспечить площадь для роста нескольких сотен клеток;
- достаточная прочность, что позволяет сохранять форму и размеры при стерилизации автоклавированием, при длительном хранении в гидратированном виде и перемешивании суспензии;
- гладкая поверхность микроносителей — необходимое условие для лучшего распластывания клеток и снижения отрицательных явлений при соударении частиц друг о друга;
- отсутствие токсических свойств для клеток;
- достаточная оптическая прозрачность, позволяющая микроскопически оценивать состояние клеточной культуры на микроносителях;
- отсутствие способности адсорбировать белки из культуральной среды.
Подавляющее большинство микроносителей обладает сферической формой, однако сообщения о положительных результатах использования волокнистых микроносителей типа ДЕ-53 Whatman свидетельствовали, что вышеописанная форма не является обязательным атрибутом эффективных микроносителей.
Существенным этапом является выбор химической основы микроносителей и технологии их получения, которые обеспечивали бы возможность придания микроносителям необходимых свойств. Кроме того, материал для их изготовления должен быть доступным и дешевым, а технология получения микроносителей из него достаточно простой.
Наиболее полно этим требованиям соответствуют микроносители на основе поперечно сшитого декстрана. Однако у получаемых на этой основе субстратов отсутствует ионный заряд, а значит, и способность обеспечивать адгезию и пролиферацию клеток, поэтому возникает необходимость их модификации. Обычно им придают положительный заряд путём введения в состав матрикса N, N-диэтил-аминоэтиловых или N, N, триметил-2-гидроксиамино-пропиловых групп, но это существенно усложняет технологию. Кроме того, возникает
необходимость в тщательном контроле величины заряда выпускаемых микроносителей, поскольку клетки весьма чувствительны к его величине, а оптимальные значения находятся в довольно узких границах — 1,5-1,8 мЭкв/г. При этом величина заряда различна для каждого типа клеток, поэтому не все клетки способны эффективно расти на таких микроносителях.