Использование хроматографии позволяет выявить то или иное вещество путем физического разделения исследуемого образца на отдельные содержащиеся в нем вещества. Это разделение достигается за счет разного для разных веществ распределения между неподвижной и подвижной фазами. Неподвижная фаза — чаще всего очень мелкие частицы геля, организованного на поверхности в виде тонкого слоя или упакованного в колонку. По мере того как подвижная фаза (образец и элюирующие растворители или растворы) протекает между этими частицами, молекулы того или иного вещества адсорбируются на поверхности частиц в соответствии со своими уникальными свойствами, что позволяет отделить их от других молекул (адсорбционный вид хроматографии). После разделения веществ их необходимо обнаружить и измерить их концентрацию, поэтому хроматографический метод всегда используется вместе с каким-либо методом детекции.
При тонкослойной хроматографии концентрированный образец разводят в небольшом объеме растворителя и наносят на тонкий слой силикагеля, находящегося на стеклянной или полимерной подложке.
При сходной по принципу высокоэффективной жидкостной хроматографии неподвижная фаза (гель, в котором происходит разделение) упакована в колонку, подвижная фаза прокачивается через нее под большим давлением. Благодаря этому достигается высокая скорость потока даже при использовании очень маленьких частиц геля. Чем меньше размер частиц, тем больше общая поверхность фазы, меньше диффузионное расстояние и выше разрешение анализа, но из-за малого расстояния между частицами больше и сопротивление потоку, для преодоления которого и необходимо высокое давление. Высокоэффективная жидкостная хроматография занимает меньше времени, чем тонкослойная.
Газовая хроматография основана на том же принципе, что высокоэффективная жидкостная, но в этом случае подвижная фаза представляет собой не жидкость, а газ (обычно гелий, в некоторых случаях азот). Из-за низкого сопротивления газовому потоку достигается его высокая скорость, что позволяет использовать для анализа значительно более длинные колонки, чем при высокоэффективной жидкостной хроматографии, добиваясь тем самым высокого разрешения.
Газовая хроматография используется только для разделения молекул, которые могут перевестись в газовую фазу при температуре ниже 300 градусов; при температуре больше 300 градусов может начаться разрушение неподвижной фазы. Летучесть вещества определяется в основном величиной его молекулы и ее способностью образовывать водородные связи. Если в формировании водородных связей участвуют аминогруппы, гидроксильные или карбоксильные группы, в такие молекулы можно ввести заместители атомов водорода, по возможности крупные; благодаря этому пространственный доступ к электронным парам на атомах азота и кислорода становится затрудненным. Для введения в молекулы групп заместителей используют различные химические реагенты. Чаще всего в молекулы вводят три мети леи л ильную группу. Полученные производные молекулы, несмотря на возросшую молекулярную массу, не образуют водородных связей и поэтому значительно легче переводятся в газовую фазу.
При проведении газовой хроматографии используют различные способы детекции, чаше всего — метод пламенной ионизации. Выходящие из колонки органические вещества сгорают, образуя заряженные промежуточные продукты окисления. Последние в электрическом поле создают электрический ток, который и измеряют. Другой метод детекции — масс-спектрометрия — имеет высокую чувствительность и специфичность. Он основан на распознавании ионизированных молекул вещества по соотношению «масса/заряд». При ионизации молекул веществ образуется, как правило, несколько таких ионов; сигнал, полученный при их регистрации, образует масс-спектр. Масс-спектр каждого вещества обычно уникален.