медицинский портал

Разделы медицины

  • Информация
    • Акушерство и гинекология
    • Детская хирургия
    • Гастроэнтерология
    • Колопроктология
    • Нейрохирургия
    • Онкология
    • Отоларингология
    • Пластическая хирургия
    • Сосудистая хирургия
    • Травматология и ортопедия
    • Урология
    • Флебология
    • Хирургия
    • Эндокринология
    • Препараты
    • Пациентам
▼ Я покупаю ссылки здесь ▼

Молекулярно-генетическая диагностика

Пост опубликован: 13.05.2014

Отдельный ген или короткие сегменты ДНК не мо­гут визуализироваться при микроскопическом ис­следовании, поэтому для идентификации мутаций применяются методы молекулярно-генетической диагностики. Информация, полученная в результате «Проекта генома человека», и другие достижения в области молекулярной генетики значительно расширили возможности пре- и постнатальной диагностики генетических заболеваний. Мето­ды молекулярно-генетической диагностики обеспечивают раннее обнаружение и прогноз моно- и полигенных заболеваний с дебютом во взрослом возрасте. Технические воз­можности молекулярно-генетической диагностики могут выхо­дить за этические рамки, установленные в отноше­нии наследственных заболеваний, особенно если эти исследования должны проводиться в детском и подростковом возрасте.

Методы молекулярной цитогенетики

Количественные и структурные аномалии хромо­сом — распространенные причины многочислен­ных пороков развития и онкологических заболева­ний. Идентификация этих хромосомных аберраций имеет важное значение при семейном консультировании для оценки прогноза и репро­дуктивного риска при будущих беременностях. Традиционный хромосомный анализ — «золотой стандарт» цитогенетической диагностики, одна­ко он имеет ограниченные возможности. Методы молекулярно-генетической диагностики с применением флюоресцирующих меток, основан­ные на технологиях клонирования, и повышенная чувствительность конъюгатов антител способству­ют выявлению тонких хромосомных изменений, не обнаруживаемых при классическом цитогене­тическом исследовании. Такие техники расширяют диагностические возможности при обследовании детей с умственной отсталостью, пороками разви­тия и многими другими заболеваниями.

Метод флюоресцентной гибридизации in situ

Метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH — fluorescence in situ hybridization) включа­ет применение уникальных нуклеотидных после­довательностей ДНК в качестве зонда для поиска нужных последовательностей ДНК в материале, полученном от пациента. Локусспецифический или генспецифический ДНК-зонд помечен опреде­ленным маркером (например, флюорохромом), что обеспечивает его обнаружение при флюоресцент­ной микроскопии. Исследуемая ДНК представляет собой препарат хромосом для микроскопического исследования, содержащий нити в метафазе и ядра в интерфазе (в неделящемся состоянии). ДНК-зонд и исследуемую ДНК денатурируют, что приводит к образованию одноцепочных ДНК. ДНК-зонд до­бавляют к препарату хромосом и инкубируют в течение времени, достаточного для гибридизации ДНК-зонда и комплементарных последовательно­стей ДНК больного, если у больного имеется уча­сток ДНК, комплементарный ДНК-зонду. Гибри­дизация происходит только на комплементарных участках ДНК и не касается фрагментов с иными последовательностями ДНК из других частей гено­ма. Присутствие или отсутствие меченного флюо­рохромом зонда в составе ДНК после гибридизации определяется при исследовании хромосом с помо­щью флюоресцентной микроскопии. Результат данного метода молекулярно-генетической диагностики, как правило, не вызывает сомнения.

Преимущества метода молекулярно-генетической диагностики FISH включают быстрый ана­лиз большого числа клеток, высокую чувствитель­ность и специфичность, возможность исследовать некультивируемые и неделящиеся клетки. С по­мощью этого метода можно исследовать клетки, содержащиеся в парафиновых срезах. Недостатки метода заключаются в невозможности получить информацию о физическом состоянии исследу­емой ДНК или участка хромосомы. Проведение FISH требует знания локуса, вовлеченного в хро­мосомную аберрацию, а также подбора соответ­ствующего ДНК-зонда, который сможет выявить данную аберрацию. FISH не используется в каче­стве скринингового метода молекулярно-генетической диагностики. Метод применяется для того, чтобы получить ответ на конкретный во­прос (определить отсутствие или наличие предпо­лагаемой специфической мутации). Как правило, он дополняет классические методы окрашивания хромосом, а также является основным способом идентификации хромосом в метафазе или интер­фазе и специфических нуклеотидных последова­тельностей ДНК, лежащих в основе определенного заболевания (фенотип).

FISH применяют в пренатальной молекулярно-генетической диагностике и для характеристики опухолей; в педиатрической практике его используют, как правило, для иденти­фикации субмикроскопических делеций, ассоции­рованных со специфическими пороками развития. Синдромы, в основе которых лежат микроделеции, раньше считались заболеваниями неизвестной этиологии, так как хромосомные делеции и пере­стройки, вызывающие развитие этих заболеваний, обычно не визуализируются при традиционных методах хромосомного анализа. Такие мелкие де­леции в специфических участках хромосом мож­но с большой точностью выявить методом FISH. К заболеваниям, обусловленным субмикроскопическими делециями, относятся синдромы Прадера-Вилли, Ангельмана, Вильямса, Миллера-Дикера, Смит-Мадженис и велокардиофациальный синдром. FISH облегчает диагностику этих синдромов в нетипичных случаях, особенно в младенческом возрасте, когда еще отсутствуют многие диагностически значимые признаки забо­левания. Применение этого метода молекулярно-генетической диагностики целесообразно также в подростковом и во взрослом возрасте, ког­да типичные клинические признаки заболевания, характерные для детского возраста, претерпевают изменения.

Субтеломерические перестановки

В большинстве случаев транслокации вовлекают концы хромосом (теломеры). Большое количество генов, лежащих в основе наследственных синдро­мов, проявляющихся в виде пороков развития, локализовано в областях, прилегающих к теломерам, в субтеломерических областях хромосомы. Скрининг теломер с целью выявить хромосомных перестроек является ценным методом идентифика­ции субмикроскопических хромосомных мутаций и перестроек, не обнаруживаемых при стандартном хромосомном анализе. FISH, применяемый для вы­явления субмикроскопических хромосомных пе­рестроек у пациентов с умственной отсталостью, фокусируется на идентификации перестроек, рас­положенных на концах хромосом; субтеломериче­ские аномалии обнаруживаются примерно у 7,5% этих пациентов.

Сравнительная геномная гибридизация

Сравнительная геномная гибридизация (СГГ) — это применение метода FISH для широкого скри­нинга генома с целью выявить различия в числе копий любых нуклеотидных последовательностей ДНК у пациента. СГГ была разработана для гене­тических исследований в сфере онкологии (пер­вичные солидные опухоли), но в настоящее время применяется для определения локализации из­быточного генетического материала или зон вы­падения участков хромосом при предполагаемых хромосомных аномалиях. Этот метод молекулярно-генетической диагностики заключается в смешивании и одновременной гибридизации рав­ных количеств меченной различными красителями тестируемой ДНК (например, меченной зеленым флюоресцирующим красителем) и нормальной референтной ДНК (например, красный флюорес­цирующий краситель) с нормальными нитями в метафазе. В результате получают определенное соотношение зеленой и красной флюоресценции. При этом зоны амплификации тестируемой ДНК (многократного копирования) выявляются как зоны избыточной концентрации зеленого кра­сителя, зоны выпадения — как красные участки, отражающие дефицит тестируемой ДНК, а при равном соотношении тестируемой и нормальной ДНК имеются области желтого цвета. Таким об­разом, СГГ позволяет получить карту нуклеотид­ных последовательностей ДНК в геноме. К пре­имуществам данного метода молекулярно-генетической диагностики относится возможность его применения к любой ткани. Метод не может вы­явить сбалансированные хромосомные аномалии, при которых количество копий ДНК не меняется. Разрешающая способность метода не позволяет идентифицировать хромосомные копии размером меньше 10 Мб, а также изменения числа копий, если выпадение участков хромосом или избыточ­ный хромосомный материал содержатся менее чем в 50% анализируемых клеток.

Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH

Ограничение возможностей СГГ при выявлении сбалансированных хромосомных перестроек вос­полняется с помощью многоцветного окрашивания всех хромосом при однократной гибридизации. Спектральное кариотипирование и многоцветная FISH (M-FISH) — взаимосвязанные методы моле­кулярно-генетического анализа, которые способны идентифицировать сбалансированные хромосом­ные перестройки. При обоих методах молекулярно-генетической диагностики каждая из хромосом в метафазе маркируется специфическим цветом, что позволяет одновременно визуализи­ровать всю совокупность хромосом. 24 маркиро­ванных хромосомных зонда и 5 флюорохромов применяются в комбинации, что приводит к соз­данию комбинаторной схемы, в которой каждая из 22 аутосом, а также X- и Y-хромосомы окраше­ны в разные цвета. M-FISH требует применения специфических комплектов фильтров для каждого из 5 флюорохромов; при спектральном кариотипировании применяются спектроскопия и интер­ферометр для оценки паттернов флюоресцентной эмиссии. Эти методы позволяют выявить сложные хромосомные перестройки, мелкие транслокации и маркированные хромосомы. Недостатки методов включают невозможность идентифицировать мел­кие интрахромосомные делеции или дупликации, а также перицентрические или парацентрические инверсии.

Методы ДНК-анализа

Молекулярные цитогенетические методы по­вышают диагностические возможности для вы­явления хромосомных делеций или дупликаций (содержащих десятки или сотни генов). Другие методы ДНК-анализа позволяют выявить измене­ния в отдельных генах. Проведение ДНК-анализа возможно в связи с тем, что ДНК — это относи­тельно стабильная молекула, которая может быть изолирована из любых ядросодержащих клеток и сохранена для дальнейших исследований. Наи­более часто ДНК выделяют из лейкоцитов; другие ткани, применяющиеся для этого, включают амни­отические клетки и ворсины хориона (при прена­тальной диагностике), клетки, полученные из маз­ка со слизистой оболочки щеки, и фибробласты, полученные при биопсии кожи. При заборе этих тканей, как правило, удается выделить достаточное количество ДНК. Современные методы молекулярно-генетической диагностики, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяют амплификацию ДНК, полученной всего из одной или нескольких клеток.

Саузерн, вестерн, нозерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг — это первый метод молекулярно-генетической диагно­стики на молекулярном уровне. Сейчас он в значительной степени вытеснен методами, основанными на ПЦР, и прямым секвенированием ДНК. С помощью саузерн-блоттинга выделяют ге­номную ДНК пациента и разрезают ее на мелкие фрагменты с помощью рестриктаз (ферменты бак­терий, которые расщепляют ДНК в строго специ­фических сайтах). Полученные фрагменты разде­ляют по размеру с использованием электрофореза в агарозном геле, переносят с помощью блоттинга на стабильный нейлоновый фильтр, фиксируют на фильтре, проводят гибридизацию с радиоактивно меченным ДНК-зондом, после чего проводят ра­диоавтографию. Данный метод молекуляно-генетической диагнстики позволяет выявлять му­тации, если они изменяют длину фрагмента ДНК (сайт рестрикции), что изменяет результирующую картину ферментного расще­пления. Саузерн-блоттинг по-прежнему наиболее часто применяется для выявления сцепления гена со специфическим врожденным полиморфизмом ДНК. Можно также проследить распространение гена у других членов семьи, даже если специфи­ческий молекулярный дефект, ассоциированный с наследственным заболеванием, не может быть идентифицирован.

При нозерн-блоттинге анализируются структу­ра и количество мРНК, продуцированной специфи­ческим геном. Расщепление РНК рестрикционны­ми ферментами невозможно. Длина транскриптов различных РНК зависит от размера и количества экзонов в гене. Таким образом, мутации, которые изменяют количество или длину экзонов, можно определять в результате выявляемых изменений РНК при нозерн-блоттинге. Методика идентична саузерн-блоттингу, за тем исключением, что иссле­дуется общая РНК клеток или очищенная мРНК, а не расщепленная рестриктазами ДНК.

Вестерн-блоттинг дает информацию о размере и количестве мутантных белков в клеточных экс­трактах, полученных от пациентов со специфи­ческими генетическими заболеваниями. Белки из клеточных экстрактов разделяют по размеру с по­мощью электрофореза в полиакриламидном геле и переносят на мембрану. Затем мембрану инку­бируют со специфическими антителами к бел­кам. Вторичные антитела (направленные против первых антител), меченные флюоресцирующим красителем Этот метод молекулярно-генетической диагностики применяется для определения наличия или отсутствия, а также размера мышечного белка дистрофина у пациентов с Х-сцепленной мышеч­ной дистрофией.

Полимеразная цепная реакция

Хотя при некоторых заболеваниях большая часть мутаций возникает в результате крупных делеций ДНК, которые выявляются с помощью саузерн-блоттинга, большинство аномалий генов, лежащих в основе многих заболеваний, представляют собой точечные мутации. После обнаружения точечной мутации можно синтезировать конструкции ДНК (праймеры), покрывающие короткий участок, пора­женный мутацией. Получение достаточного коли­чества копий измененной ДНК может быть сложно, но ПЦР предоставляет множественные копии спе­цифических фрагментов ДНК. При ПЦР ампли­фикация ДНК осуществляется путем повторных тепловых циклов. ПЦР произвела революцию в диагностике мутаций. Это высокочувствительный, стандартизированный и автоматический метод молекулярно-генетической диагностики, который можно проводить на малом количестве образцов. Метод относительно недорог, в течение нескольких часов можно получить миллиарды ко­пий специфических нуклеотидных последователь­ностей ДНК.

Прямое секвенирование ДНК

Автоматизированное секвенирование ДНК стало стандартным методом молекулярно-генетической диагностики во многих клинических ла­бораториях молекулярной генетики и способство­вало значительному прогрессу «Проекта генома человека». Секвенирование ДНК особенно полезно в случаях небольших генов и в ситуациях, когда точная мутация у членов данной семьи неизвест­на. Все выявленные изменения в структуре гена должны быть тщательно проанализированы, чтобы понять, лежат ли они в основе заболевания или от­носятся к нормальному полиморфизму.


Статью подготовил и отредактировал: врач-хирург Пигович И.Б.

Видео:

Полезно:

11 thoughts on “Молекулярно-генетическая диагностика

  1. Слышал существует возможность сдать анализы паре для проверки на риски заболевания их чада генетическими недугами перед планированием беременности. Где можно пройти такой тест и как определяются заболевания на которые стоит исследоваться?

  2. В скором времени вообще можно будет недорого сделать полное генетическое картирование. Обещают, что в ближайшие годы стоимость снизится до $300! Там не надо будет выбирать, какие исследования определять а какие нет).

  3. Вопрос к педиатрам. Как часто вы встречали ложно положительные результаты генетического скринингового теста новорожденных?

  4. детский врач говорит :

    Такое бывает, но не часто. На моем опыте за 13 лет 8 раз.

  5. Спасибо. Произошло в семье близких друзей. Ждем результатам генетического исследования.

  6. Был в 2012 году, хотели что бы родители отказались от ребенка. Криминал.

  7. Читала о том, что в Европе собираются разрабатывать метода генетического тестирования перед назначением препаратов, в первую очередь кардиологических. Честно говоря, пока не очень понятно, каким образом это будет происходить.
    Кто-нибудь слышал о таком и как Вы это понимаете?

  8. Фармакогенетика давно занимается проблемой подбора лекарств, еще в начале 50-х годов изучали гипертоксические эффекты от приема терапевтических доз изониазида ( фермент N-ацетилтрасфераза регулирует ацетилирование и выведение этого препарата, при мутации в гене скорость выведения зачительно падает). Установлены гены и описаны мутации отвечающие за метаболизм антикоагулянтов, миорелаксантов, сульфаниламидов и др.

  9. С Варфарином, мало того что реально, так еще и необходимо.

  10. Алтай Зейнуллин говорит :

    Молекулярная диагностика это наша будивший в конце 21-веке все люди будут долго жителями.

Добавить комментарий для Алтай Зейнуллин Отменить ответ

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Купить другую книгу из каталога

Медицинский сайт Surgeryzone

© 2010  
Информация не является указанием для лечения. По всем вопросам обязательна консультация врача.




Adblock detector